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中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)
GB 4789.39—2013
食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)
食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 糞大腸菌群計(jì)數(shù)
2013-11-29 發(fā)布 2014-06-01 實(shí)施
GB 4789.39—2013
I
前 言
本標(biāo)準(zhǔn)代替GB/T 4789.39-2008《食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn) 糞大腸菌群計(jì)數(shù)》。
本標(biāo)準(zhǔn)與GB/T 4789.39-2008相比，主要修改如下：
——修改了標(biāo)準(zhǔn)的中文名稱；
——修改了操作步驟；
——增加了附錄B。
GB 4789.39—2013
1
食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)
食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 糞大腸菌群計(jì)數(shù)
1 范圍
本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了食品中糞大腸菌群計(jì)數(shù)的方法。
本標(biāo)準(zhǔn)適用于各類食品中糞大腸菌群的計(jì)數(shù)。
2 術(shù)語和定義
2.1 糞大腸菌群
一群在44.5 ℃培養(yǎng)24h～48 h能發(fā)酵乳糖、產(chǎn)酸產(chǎn)氣的需氧和兼性厭氧革蘭氏陰性無芽胞桿菌。該菌
群來自人和溫血?jiǎng)游锛S便，作為糞便污染指標(biāo)評價(jià)食品的衛(wèi)生狀況，推斷食品中腸道致病菌污染的可能性。
3 技術(shù)要求設(shè)備和材料
除微生物實(shí)驗(yàn)室常規(guī)滅菌及培養(yǎng)設(shè)備外，其他設(shè)備和材料如下：
a) 恒溫培養(yǎng)箱：36℃±1 ℃;
b) 冰箱：2 ℃～5 ℃;
c) 恒溫水浴箱：44.5 ℃±0.2 ℃;
d) 天平：感量0.1 g;
e) 均質(zhì)器;
f) 振蕩器;
g) 無菌吸管：1 mL（具 0.01 mL 刻度）、10 mL（具 0.1 mL 刻度）或微量移液器及吸頭;
h) 無菌錐形瓶：容量 500 mL;
i) 無菌培養(yǎng)皿：直徑 90 mm;
j) pH 計(jì)或 pH 比色管或精密 pH 試紙。
4 培養(yǎng)基及試劑
4.1 月桂基硫酸鹽胰蛋白胨（Lauryl Sulfate Tryptose，LST）肉湯：見附錄 A 中 A.1。
4.2 EC 肉湯（E.coli Broth）：見附錄 A 中 A.2。
4.3 無菌生理鹽水：見附錄 A 中 A.3。
4.4 1mol/L NaOH：見附錄 A 中 A.4。
4.5 1mol/L HCl：見附錄 A 中 A.5。
5 檢驗(yàn)程序
糞大腸菌群檢驗(yàn)程序見圖1。
GB 4789.39—2013
2
圖1 糞大腸菌群 MPN 計(jì)數(shù)法檢驗(yàn)程序
6 操作步驟
6.1 樣品的稀釋
6.1.1 固體和半固體樣品：稱取25 g樣品，置盛有225 mL磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無菌均質(zhì)杯內(nèi)，8000
r/min～10 000 r/min 均質(zhì) 1 min～2 min，制成1:10 樣品勻液，或置 225 mL 稀釋液的無菌均質(zhì)袋中，用拍打
式均質(zhì)器拍打 1 min～2 min，制成 1:10 的樣品勻液。
6.1.2 液體樣品：以無菌吸管吸取樣品 25 mL 置盛有 225 mL 磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無菌錐形瓶（瓶
內(nèi)預(yù)置適當(dāng)數(shù)量的無菌玻璃珠）中，充分混勻，制成1:10 的樣品勻液。
6.1.3 樣品勻液的 pH 值應(yīng)在 6.5～7.5 之間，必要時(shí)分別用 1 mol/L NaOH 或 1 mol/L HCl 調(diào)節(jié)。
6.1.4 用 1 mL 無菌吸管或微量移液器吸取 1:10 樣品勻液 1 mL，沿管壁緩緩注入盛有 9 mL 磷酸鹽緩沖
液或生理鹽水的無菌試管中（注意吸管或吸頭尖端不要觸及稀釋液面），振搖試管或換用1 支1 mL 無菌
吸管反復(fù)吹打，使其混合均勻，制成 1:100 的樣品勻液。
6.1.5 根據(jù)對樣品污染狀況的估計(jì)，依次制成十倍遞增系列稀釋樣品勻液。每遞增稀釋 1 次，換用 1 支 1
mL 無菌吸管或吸頭。從制備樣品勻液至樣品接種完畢，全過程不得超過 15 min。
6.2 初發(fā)酵試驗(yàn)
檢 樣
25g(mL)樣品+ 225mL 稀釋液，均質(zhì)
10 倍系列稀釋
月桂基硫酸鹽胰蛋白胨 (LST)肉湯
36℃±1℃48h±2h
不產(chǎn)氣 產(chǎn)氣
EC 肉湯
44.5℃±0.2℃24h±2h
不產(chǎn)氣 產(chǎn)氣
糞大腸菌群陰性管 糞大腸菌群陽性管
查 MPN 表
報(bào)告結(jié)果
GB 4789.39—2013
3
每個(gè)樣品，選擇3個(gè)適宜的連續(xù)稀釋度的樣品勻液（液體樣品可以選擇原液），每個(gè)稀釋度接種3管月
桂基硫酸鹽胰蛋白胨（LST）肉湯，每管接種1 mL（如接種量需要超過1mL，則用雙料LST肉湯），36 ℃±1
℃培養(yǎng)24 h±2 h，觀察倒管內(nèi)是否有氣泡產(chǎn)生，24 h產(chǎn)氣者進(jìn)行復(fù)發(fā)酵試驗(yàn)，如未產(chǎn)氣則繼續(xù)培養(yǎng)至48 h±2
h。記錄在24 h和48 h內(nèi)產(chǎn)氣的LST肉湯管數(shù)。未產(chǎn)氣者為糞大腸菌群陰性，產(chǎn)氣者則進(jìn)行復(fù)發(fā)酵試驗(yàn)。
如采用多個(gè)稀釋度，最終確定最適的三個(gè)連續(xù)稀釋度方法參見附錄B。
6.3 復(fù)發(fā)酵試驗(yàn)
用接種環(huán)從產(chǎn)氣的LST肉湯管中分別取培養(yǎng)物1環(huán)，移種于預(yù)先升溫至44.5 ℃的EC肉湯管中。將所有
接種的EC肉湯管放入帶蓋的44.5 ℃±0.2 ℃恒溫水浴箱內(nèi)，培養(yǎng)24 h±2 h，水浴箱的水面應(yīng)高于肉湯培養(yǎng)基
液面，記錄EC肉湯管的產(chǎn)氣情況。產(chǎn)氣管為糞大腸菌群陽性，不產(chǎn)氣為糞大腸菌群陰性。
定期以已知為44.5 ℃產(chǎn)氣陽性的大腸桿菌和44.5 ℃不產(chǎn)氣的產(chǎn)氣腸桿菌或其他大腸菌群細(xì)菌作陽性
和陰性對照。
6.4 糞大腸菌群 MPN 計(jì)數(shù)的報(bào)告
根據(jù)證實(shí)為糞大腸菌群的陽性管數(shù)，查糞大腸菌群最可能數(shù)（MPN）檢索表（見附錄C），報(bào)告每g (mL)
糞大腸菌群的MPN值。
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4
附錄A
培養(yǎng)基和試劑
A.1 月桂基硫酸鹽胰蛋白胨（Lauryl Sulfate Tryptose，LST）肉湯
A.1.1 成分
胰蛋白胨或胰酪胨 20.0 g
氯化鈉 5.0 g
乳糖 5.0 g
磷酸氫二鉀（K 2 HPO 4 ） 2.75 g
磷酸二氫鉀（KH 2 PO 4 ） 2.75 g
月桂基硫酸鈉 0.1 g
蒸餾水 1 000.0 mL
A.1.2 制法
將A.1.1 成分溶解于蒸餾水中，校正pH至6.8±0.2。分裝到有玻璃小倒管的試管中，每管10 mL，121 ℃
高壓滅菌15min。
A.2 EC肉湯（E.coli Broth）
A.2.1 成分
胰蛋白胨或胰酪胨 20.0 g
3號膽鹽或混合膽鹽 1.5 g
乳糖 5.0 g
磷酸氫二鉀（K 2 HPO 4 ） 4.0 g
磷酸二氫鉀（KH 2 PO 4 ） 1.5 g
氯化鈉 5.0 g
蒸餾水 1 000.0 mL
A.2.2 制法
將 A.2.1 成分溶解于蒸餾水中，校正 pH 至 6.9±0.1。分裝到有玻璃小倒管的試管中，每管 8 mL，121
℃高壓滅菌15 min。
A.3 無菌生理鹽水
A.3.1 成分
氯化鈉 8.5 g
蒸餾水 1 000.0 mL
A.3.2 制法
GB 4789.39—2013
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稱取 8.5 g 氯化鈉溶于 1000 mL 蒸餾水中，121℃高壓滅菌 15 min。
A.4 1 mol/L NaOH
A.4.1 成分
NaOH 40.0 g
蒸餾水 1 000.0 mL
A.4.2 制法
稱取40g 氫氧化鈉溶于1000 mL蒸餾水中。
A.5 1 mol/L HCl
A.5.1 成分
鹽酸 90.0 mL
蒸餾水 1 000.0 mL
A.5.2 制法
移取鹽酸 90 mL，用蒸餾水稀釋至 1000 mL。
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附錄 B
確定最適的三個(gè)連續(xù)稀釋度方法
在10 -1 ～10 -5 五個(gè)連續(xù)稀釋度中確定最適的三個(gè)連續(xù)稀釋度方法如下：
a）有一個(gè)以上的稀釋度3管均為陽性。選擇三管都是陽性結(jié)果的最高稀釋度及其相連的兩個(gè)更高稀
釋度（見表B.1示例a、b，表中帶下劃線的數(shù)字對應(yīng)的接種樣品量為最終選取的最適稀釋度，下
同）；在未選擇的較高稀釋度中還有陽性結(jié)果時(shí)，則順次下移到下一個(gè)更高三個(gè)連續(xù)稀釋度（見
表B.1示例c）；如果中間有某個(gè)稀釋度沒有陽性結(jié)果，但更高稀釋度有陽性結(jié)果，則將此陽性結(jié)
果加到前一稀釋度，進(jìn)而確定三個(gè)連續(xù)稀釋度（見表B.1示例d）；如果不能按照這個(gè)原則找到三
個(gè)合適的稀釋度，則選擇前一個(gè)較低的稀釋度（見表B.1示例e）;
b）沒有任何一個(gè)稀釋度3管均為陽性。如果沒有一個(gè)稀釋度的3管均為陽性，則選擇三個(gè)最低稀釋度
（見表B.1示例f）；如果在更高的沒有被選擇的稀釋度還有陽性結(jié)果，將此陽性結(jié)果加到選擇的
最高稀釋度，進(jìn)而確定三個(gè)連續(xù)稀釋度（見表B.1示例g）。MPN計(jì)算陽性結(jié)果的選擇示例見表B.1。
表 B.1 關(guān)于 MPN 計(jì)算陽性結(jié)果的選擇示例
示例編
號
接種樣品量
mL
選擇的三個(gè)連續(xù)稀釋度陽性
管數(shù)
MPN/g(mL)
0.1g 0.01 g 0.001 g 0.0001 g 0.00001 g
a 3 3 1 0 0 3-1-0 430
b 2 3 1 0 0 3-1-0 430
c 3 2 2 1 0 2-2-1 280
d 3 2 2 0 1 2-2-1 280
e 3 3 3 3 2 3-3-2 110000
f 0 0 1 0 0 0-0-1 3
g 2 2 1 1 0 2-2-2 35
注：下劃線表示應(yīng)選擇的連續(xù)稀釋度。
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附錄 C
糞大腸菌群最可能數(shù)（MPN）表
每g(mL)檢樣中糞大腸菌群最可能數(shù)（MPN）的檢索見表C.1。
表C.1 糞大腸菌群最可能數(shù)（MPN）檢索表
陽性管數(shù)
MPN
95%置信區(qū)間 陽性管數(shù)
MPN
95%置信區(qū)間
0.1 0.01 0.001 下限 上限 0.1 0.01 0.001 下限 上限
0 0 0 <3.0 — 9.5 2 2 0 21 4.5 42
0 0 1 3.0 0.15 9.6 2 2 1 28 8.7 94
0 1 0 3.0 0.15 11 2 2 2 35 8.7 94
0 1 1 6.1 1.2 18 2 3 0 29 8.7 94
0 2 0 6.2 1.2 18 2 3 1 36 8.7 94
0 3 0 9.4 3.6 38 3 0 0 23 4.6 94
1 0 0 3.6 0.17 18 3 0 1 38 8.7 110
1 0 1 7.2 1.3 18 3 0 2 64 17 180
1 0 2 11 3.6 38 3 1 0 43 9 180
1 1 0 7.4 1.3 20 3 1 1 75 17 200
1 1 1 11 3.6 38 3 1 2 120 37 420
1 2 0 11 3.6 42 3 1 3 160 40 420
1 2 1 15 4.5 42 3 2 0 93 18 420
1 3 0 16 4.5 42 3 2 1 150 37 420
2 0 0 9.2 1.4 38 3 2 2 210 40 430
2 0 1 14 3.6 42 3 2 3 290 90 1,000
2 0 2 20 4.5 42 3 3 0 240 42 1,000
2 1 0 15 3.7 42 3 3 1 460 90 2,000
2 1 1 20 4.5 42 3 3 2 1100 180 4,100
2 1 2 27 8.7 94 3 3 3 >1100 420 —
注 1：本表采用 3 個(gè)稀釋度[0.1g(mL)、0.01g(mL)和 0.001g(mL)]、每個(gè)稀釋度接種 3 管。
注 2：表內(nèi)所列檢樣量如改用 lg（mL）、0.1g(mL)和 0.01g(mL)時(shí)，表內(nèi)數(shù)字應(yīng)相應(yīng)降低 10 倍；如改用 0.01g(mL)、
0.001g(mL)、0.0001g(mL)時(shí)，則表內(nèi)數(shù)字應(yīng)相應(yīng)增高 10 倍，其余類推。