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GB/T 4789
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GB/T 4789.38-2012 食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗 大腸埃希氏菌計數(shù)
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中 華 人 民 共 和 國 國 家 標(biāo) 準(zhǔn)
GB 4789.38-2012
食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)
食品微生物學(xué)檢驗 大腸埃希氏菌計數(shù)
中 華 人 民 共 和 國 衛(wèi) 生 部
發(fā)布
2012-05-17 發(fā)布 2012-07-17 實施
GB 4789.38-2012
I
前 言
本標(biāo)準(zhǔn)代替 GB/T 4789.38-2008 《食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗 大腸桿菌計數(shù)》。
本標(biāo)準(zhǔn)與 GB/T 4789.38-2008 相比,主要變化如下:
——修改了標(biāo)準(zhǔn)的中文名稱;
——修改了培養(yǎng)基和試劑;
——將“第二法 大腸桿菌 VRB-MUG 平板計數(shù)法”改為“大腸埃希氏菌平板計數(shù)法(第二法)”;
——刪除了“第三法 大腸桿菌 Petrifilm TM 測試片計數(shù)法”;
——修改了附錄 A。
GB 4789.38-2012
1
食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)
食品微生物學(xué)檢驗 大腸埃希氏菌計數(shù)
1 范圍
本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了食品中大腸埃希氏菌(Escherichia coli)計數(shù)的方法。
本標(biāo)準(zhǔn)適用于食品中大腸埃希氏菌的計數(shù),其中大腸埃希氏菌平板計數(shù)法(第二法)不適用于貝類產(chǎn)
品。
2 術(shù)語和定義
2.1 大腸埃希氏菌 Escherichia coli
大腸桿菌
廣泛存在于人和溫血動物的腸道中,能夠在44.5℃發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣,IMViC(靛基質(zhì)、甲基紅、VP
試驗、檸檬酸鹽)生化試驗為++--或-+--的革蘭氏陰性桿菌。以此作為糞便污染指標(biāo)來評價食品
的衛(wèi)生狀況,推斷食品中腸道致病菌污染的可能性。
2.2 最可能數(shù)
基于泊松分布的一種間接計數(shù)方法,簡稱為MPN。
3 設(shè)備和材料
除微生物實驗室常規(guī)滅菌及培養(yǎng)設(shè)備外,其他設(shè)備和材料如下:
a) 恒溫培養(yǎng)箱:36 ℃±1 ℃;
b) 冰箱:2 ℃~5 ℃;
c) 恒溫水浴箱:44.5 ℃±0.2 ℃;
d) 天平:感量為 0.1 g;
c) 均質(zhì)器;
d) 振蕩器;
e) 無菌吸管:1 mL(具 0.01 mL 刻度)、10 mL(具 0.1 mL 刻度)或微量移液器及吸頭;
f) 無菌錐形瓶:容量 500 mL;
g) 無菌培養(yǎng)皿:直徑 90 mm;
h) pH 計或 pH 比色管或精密 pH 試紙;
i) 菌落計數(shù)器;
j) 紫外燈:波長 360 nm~366 nm,功率≤6 W。
4 培養(yǎng)基和試劑
4.1 月桂基硫酸鹽胰蛋白胨(LST)肉湯:見附錄 A 中 A.1。
4.2 EC 肉湯(E.coli broth):見附錄 A 中 A.2。
4.3 蛋白胨水:見附錄 A 中 A.3。
GB 4789.38-2012
2
4.4 緩沖葡萄糖蛋白胨水[甲基紅(MR)和 V-P 試驗用]:見附錄 A 中 A.4。
4.5 西蒙氏檸檬酸鹽培養(yǎng)基:見附錄 A 中 A.5。
4.6 磷酸鹽緩沖液:見附錄 A 中 A.6。
4.7 伊紅美藍(lán)(EMB)瓊脂:見附錄 A 中 A.7。
4.8 營養(yǎng)瓊脂斜面:見附錄 A 中 A.8。
4.9 結(jié)晶紫中性紅膽鹽瓊脂(VRBA):見附錄 A 中 A.9。
4.10 結(jié)晶紫中性紅膽鹽-4-甲基傘形酮-β-D-葡萄糖苷瓊脂(VRBA-MUG):見附錄 A 中 A.10。
4.11 革蘭氏染色液:見附錄 A 中 A.11。
4.12 Kovacs 靛基質(zhì)試劑:見附錄 A 中 A.12。
4.13 無菌 1 mol/L NaOH:見附錄 A 中 A.13。
4.14 無菌 1 mol/L HCl:見附錄 A 中 A.14。
GB 4789.38-2012
3
5 大腸埃希氏菌 MPN 計數(shù)(第一法)
5.1 檢驗程序
大腸埃希氏菌MPN計數(shù)的檢驗程序見圖1。
圖1 大腸埃希氏菌MPN計數(shù)法檢驗程序
不產(chǎn)氣
36℃±1℃ 18h~24h
36℃±1℃ 18h~24h
36℃±1℃ 48h±2h
44.5℃±0.2℃ 48 h±2 h
檢樣
25g(mL)樣品+ 225ml 稀釋液,均質(zhì)
10 倍系列稀釋
選擇適宜 3 個連續(xù)稀釋度的樣品勻液,接種 LST 肉湯管
產(chǎn)氣
EC 肉湯
不產(chǎn)氣 產(chǎn)氣
EMB 平板劃線
可疑菌落移種營養(yǎng)瓊脂斜面或平板
IMViC 生化試驗,革蘭氏染色
陰性管 陽性管
查 MPN 表
報 告
GB 4789.38-2012
4
5.2 操作步驟
5.2.1 樣品的稀釋
5.2.1.1 固體和半固體樣品:稱取 25 g 樣品,放入盛有 225 mL 磷酸鹽緩沖液的無菌均質(zhì)杯內(nèi),8 000
r/min~10 000 r/min 均質(zhì) 1 min~2 min,制成 1:10 樣品勻液,或放入盛有 225 mL 磷酸鹽緩沖液的無菌均質(zhì)
袋中,用拍擊式均質(zhì)器拍打 1 min~2 min 制成 1:10 的樣品勻液。
5.2.1.2 液體樣品:以無菌吸管吸取 25 mL 樣品置盛有 225 mL 磷酸鹽緩沖液的無菌錐形瓶(瓶內(nèi)預(yù)置適
當(dāng)數(shù)量的無菌玻璃珠)中,充分混勻,制成 1:10 的樣品勻液。
5.2.1.3 樣品勻液的 pH 值應(yīng)在 6.5~7.5 之間,必要時分別用 1 mol/L NaOH 或 1 mol/L HCl 調(diào)節(jié)。
5.2.1.4 用 1 mL 無菌吸管或微量移液器吸取 1:10 樣品勻液 1 mL,沿管壁緩緩注入 9 mL 磷酸鹽緩沖液
的無菌試管中(注意吸管或吸頭尖端不要觸及稀釋液面),振搖試管或換用 1 支 1 mL 無菌吸管或吸頭反復(fù)
吹打,使其混合均勻,制成 1:100 的樣品勻液。
5.2.1.5 根據(jù)對樣品污染狀況的估計,按上述操作,依次制成10倍遞增系列稀釋樣品勻液。每遞增稀釋1
次,換用1支1 mL無菌吸管或吸頭。從制備樣品勻液至樣品接種完畢,全過程不得超過15 min。
5.2.2 初發(fā)酵試驗
每個樣品,選擇 3 個適宜的連續(xù)稀釋度的樣品勻液(液體樣品可以選擇原液),每個稀釋度接種 3 管
月桂基硫酸鹽胰蛋白胨(LST)肉湯,每管接種 1 mL(如接種量超過 1 mL,則用雙料 LST 肉湯),36 ℃±1 ℃
培養(yǎng)24 h±2 h,觀察小倒管內(nèi)是否有氣泡產(chǎn)生,24 h±2 h產(chǎn)氣者進(jìn)行復(fù)發(fā)酵試驗,如未產(chǎn)氣則繼續(xù)培養(yǎng)48 h±2
h。產(chǎn)氣者進(jìn)行復(fù)發(fā)酵試驗。如所有 LST 肉湯管均未產(chǎn)氣,即可報告大腸埃希氏菌 MPN 結(jié)果。
5.2.3 復(fù)發(fā)酵試驗
用接種環(huán)從產(chǎn)氣的 LST 肉湯管中分別取培養(yǎng)物 1 環(huán),移種于已提前預(yù)溫至 45 ℃的 EC 肉湯管中,放
入帶蓋的 44.5 ℃±0.2 ℃水浴箱內(nèi)。水浴的水面應(yīng)高于肉湯培養(yǎng)基液面,培養(yǎng) 24 h±2 h,檢查小倒管內(nèi)是否
有氣泡產(chǎn)生,如未有產(chǎn)氣則繼續(xù)培養(yǎng)至 48 h±2 h。記錄在 24 h 和 48 h 內(nèi)產(chǎn)氣的 EC 肉湯管數(shù)。如所有 EC
肉湯管均未產(chǎn)氣,即可報告大腸埃希氏菌 MPN 結(jié)果;如有產(chǎn)氣者,則進(jìn)行 EMB 平板分離培養(yǎng)。
5.2.4 伊紅美藍(lán)平板分離培養(yǎng)
輕輕振搖各產(chǎn)氣管,用接種環(huán)取培養(yǎng)物分別劃線接種于 EMB 平板,36 ℃±1 ℃培養(yǎng) 18 h~24 h。觀察
平板上有無具黑色中心有光澤或無光澤的典型菌落。
5.2.5 營養(yǎng)瓊脂斜面或平板培養(yǎng)
從每個平板上挑 5 個典型菌落,如無典型菌落則挑取可疑菌落。用接種針接觸菌落中心部位,移種到
營養(yǎng)瓊脂斜面或平板上,36 ℃±1 ℃,培養(yǎng) 18 h~24 h。取培養(yǎng)物進(jìn)行革蘭氏染色和生化試驗。
5.2.6 鑒定
取培養(yǎng)物進(jìn)行靛基質(zhì)試驗、MR-VP 試驗和檸檬酸鹽利用試驗。大腸埃希氏菌與非大腸埃希氏菌的生
化鑒別見表 1。
GB 4789.38-2012
5
表 1 大腸埃希氏菌與非大腸埃希氏菌的生化鑒別
靛基質(zhì)(I) 甲基紅(MR) VP試驗(VP) 檸檬酸鹽(C) 鑒定(型別)
+
-
+
+
-
-
-
-
典型大腸埃希氏菌
非典型大腸埃希氏菌
+
-
+
+
-
-
+
+
典型中間型
非典型中間型
-
+
-
-
+
+
+
+
典型產(chǎn)氣腸桿菌
非典型產(chǎn)氣腸桿菌
注1:如出現(xiàn)表1以外的生化反應(yīng)類型,表明培養(yǎng)物可能不純,應(yīng)重新劃線分離,必要時做重復(fù)試驗。
注2:生化試驗也可以選用生化鑒定試劑盒或全自動微生物生化鑒定系統(tǒng)等方法,按照產(chǎn)品說明書進(jìn)行操作。
5.3 大腸埃希氏菌 MPN 計數(shù)的報告
大腸埃希氏菌為革蘭氏陰性無芽胞桿菌,發(fā)酵乳糖、產(chǎn)酸、產(chǎn)氣,IMViC 生化試驗為++――或-+
--。只要有 1 個菌落鑒定為大腸埃希氏菌,其所代表的 LST 肉湯管即為大腸埃希氏菌陽性。依據(jù) LST
肉湯陽性管數(shù)查 MPN 表(見附錄 B),報告每 g(mL)樣品中大腸埃希氏菌 MPN 值。
6 大腸埃希氏菌平板計數(shù)法(第二法)
6.1 檢驗程序
大腸埃希氏菌平板計數(shù)法的檢驗程序見圖2。
圖 2 大腸埃希氏菌平板計數(shù)法檢驗程序
6.2 操作步驟
6.2.1 樣品的稀釋
按5.2.1進(jìn)行。
6.2.2 平板計數(shù)
檢樣
25g(ml)樣品+225ml 稀釋液,均質(zhì)
選擇 2 個~3 個適宜連續(xù)稀釋度的樣品勻液,接種 VRBA-MUG 平板
10 倍系列稀釋
紫外燈照射,計數(shù)發(fā)熒光菌落
報告結(jié)果
36 ℃±1 ℃ 18 h~24 h
GB 4789.38-2012
6
6.2.2.1 選取 2 個~3 個適宜的連續(xù)稀釋度的樣品勻液,每個稀釋度接種 2 個無菌平皿,每皿 1 mL。同時
取 1 mL 稀釋液加入無菌平皿做空白對照。
6.2.2.2 將10 mL~15 mL 冷至45 ℃±0.5 ℃的結(jié)晶紫中性紅膽鹽瓊脂(VRBA)傾注于每個平皿中。小心
旋轉(zhuǎn)平皿,將培養(yǎng)基與樣品勻液充分混勻。待瓊脂凝固后,再加3 mL~4 mL VRBA-MUG覆蓋平板表層。
凝固后翻轉(zhuǎn)平板,36 ℃±1 ℃培養(yǎng)18 h~24 h。
6.3 平板菌落數(shù)的選擇
選擇菌落數(shù)在10 CFU~100 CFU之間的平板,暗室中360 nm~366 nm 波長紫外燈照射下,計數(shù)平板
上發(fā)淺藍(lán)色熒光的菌落。
檢驗時用已知MUG陽性菌株(如大腸埃希氏菌 ATCC 25922)和產(chǎn)氣腸桿菌(如ATCC 13048)做陽
性和陰性對照。
6.4 大腸埃希氏菌平板計數(shù)的報告
兩個平板上發(fā)熒光菌落數(shù)的平均數(shù)乘以稀釋倍數(shù),報告每g (mL)樣品中大腸埃希氏菌數(shù),以CFU/g (mL)
表示。若所有稀釋度(包括液體樣品原液)平板均無菌落生長,則以小于1乘以最低稀釋倍數(shù)報告。
GB 4789.38-2012
7
附錄A
培養(yǎng)基和試劑
A.1 月桂基硫酸鹽胰蛋白胨(LST)肉湯
A.1.1 成分
胰蛋白胨或胰酪胨 20.0 g
氯化鈉 5.0 g
乳糖 5.0 g
磷酸氫二鉀(K 2 HPO 4 ) 2.75 g
磷酸二氫鉀(KH 2 PO 4 ) 2.75 g
月桂基硫酸鈉 0.1 g
蒸餾水 1 000 .0mL
pH6.8±0.2
A.1.2 制法
將上述成分溶解于蒸餾水中,調(diào)節(jié)pH。分裝到有玻璃小倒管的試管中,每管10 mL。121 ℃高壓滅菌 15
min。
制備雙料 LST 肉湯時,除蒸餾水外其他成分加倍。
A.2 EC 肉湯( E.coli broth)
A.2.1 成分
胰蛋白胨或胰酪胨 20.0 g
3 號膽鹽或混合膽鹽 1.5g
乳糖 5.0 g
磷酸氫二鉀(K 2 HPO 4 ) 4.0 g
磷酸二氫鉀(KH 2 PO 4 ) 1.5 g
氯化鈉 5.0 g
蒸餾水 1 000.0 mL
pH6.9±0.1
A.2.2 制法
將上述成分溶解于蒸餾水中,調(diào)節(jié)pH,分裝到有玻璃小倒管的試管中,每管8 mL。121 ℃高壓滅菌15
min。
A.3 蛋白胨水
A.3.1 成分
胰胨或胰酪胨 10.0 g
蒸餾水 1 000.0 mL
pH6.9±0.2
A.3.2 制法
加熱攪拌溶解胰胨或胰酪胨于蒸餾水中。分裝試管,每管5 mL。121 ℃高壓滅菌15 min。
A.4 緩沖葡萄糖蛋白胨水[甲基紅(MR)和 V-P 試驗用]
A.4.1 成分
多胨 7.0 g
GB 4789.38-2012
8
葡萄糖 5.0 g
磷酸氫二鉀(K 2 HPO 4 ) 5.0 g
蒸餾水 1 000.0 mL
pH7.0
A.4.2 制法
將上述成分溶解于蒸餾水中,調(diào)節(jié)pH,分裝試管,每管1 mL,121 ℃高壓滅菌15 min,備用。
A.4.3 甲基紅(MR)試驗
A.4.3.1 甲基紅試劑
A.4.3.1.1 成分
甲基紅 10 mg
95%乙醇 30.0 mL
蒸餾水 20.0 mL
A.4.3.1.2 制法
10 mg甲基紅溶于30 mL95%乙醇中,然后加入20 mL蒸餾水。
A.4.3.1.3 試驗方法
取適量瓊脂培養(yǎng)物接種于緩沖葡萄糖蛋白胨水,36 ℃±1 ℃培養(yǎng)2 d~5 d。滴加甲基紅試劑一滴,立
即觀察結(jié)果。鮮紅色為陽性,黃色為陰性。
A.4.4 V-P 試驗
A.4.4.1 6%α-萘酚-乙醇溶液
成分及制法:取α-萘酚6.0 g,加無水乙醇溶解,定容至100 mL。
A.4.4.2 40%氫氧化鉀溶液
成分及制法:取氫氧化鉀40 g,加蒸餾水溶解,定容至100 mL。
A.4.4.3 試驗方法
取適量瓊脂培養(yǎng)物接種于緩沖葡萄糖蛋白胨水,36 ℃±1 ℃培養(yǎng)2 d~4 d。加入6% α-萘酚-乙醇溶液0.5
mL和40 %氫氧化鉀溶液0.2 mL,充分振搖試管,觀察結(jié)果。陽性反應(yīng)立刻或于數(shù)分鐘內(nèi)出現(xiàn)紅色,如為陰
性,應(yīng)放在36 ℃±1 ℃繼續(xù)培養(yǎng)4 h 再進(jìn)行觀察。
A.5 西蒙氏檸檬酸鹽培養(yǎng)基
A.5.1 成分
檸檬酸鈉 2.0 g
氯化鈉 5.0 g
磷酸氫二鉀 1.0 g
磷酸二氫銨 1.0 g
硫酸鎂 0.2 g
溴百里香酚藍(lán) 0.08 g
瓊脂 8.0 g~18.0g
蒸餾水 1 000.0 mL
pH 6.8±0.2
A.5.2 制法
將各成分加熱溶解,必要時調(diào)節(jié) pH。每管分裝 10 mL,121 ℃高壓 15 min,制成斜面。
A.5.3 實驗方法
挑取培養(yǎng)物接種于整個培養(yǎng)基斜面,36 ℃±1 ℃培養(yǎng)24 h±2 h,觀察結(jié)果。陽性者培養(yǎng)基變?yōu)樗{(lán)色。
A.6 磷酸鹽緩沖液
A.6.1 成分
GB 4789.38-2012
9
磷酸二氫鉀(KH 2 PO 4 ) 34.0g
蒸餾水 500.0 mL
pH7.2
A.6.2 制法
貯存液:稱取34.0 g的磷酸二氫鉀溶于500 mL蒸餾水中,用大約175 mL的1 mol/L氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH,用
蒸餾水稀釋至1000 mL后貯存于冰箱。
稀釋液:取貯存液1.25 mL,用蒸餾水稀釋至1 000 mL,分裝于適宜容器中,121 ℃高壓滅菌15 min。
A.7 伊紅美藍(lán)(EMB)瓊脂
A.7.1 成分
蛋白胨 10.0 g
乳糖 10.0 g
磷酸氫二鉀(K 2 HPO 4 ) 2.0 g
瓊脂 15.0 g
伊紅γ(水溶液) 0.4 g或2%水溶液20.0 mL
美藍(lán) 0.065 g或0.5%水溶液13.0 mL
蒸餾水 1 000.0 mL
pH7.1±0.2
A.7.2 制法
在1 000 mL蒸餾水中煮沸溶解蛋白胨、磷酸鹽和瓊脂,加水補(bǔ)足。分裝于三角燒瓶中。每瓶100 mL或
200 mL,調(diào)節(jié)pH,121 ℃高壓滅菌15 min。使用前將瓊脂融化,于每100 mL瓊脂中加5 mL滅菌的20%乳糖
溶液,2 mL的2%的伊紅γ水溶液和1.3 mL 0.5%的美藍(lán)水溶液,搖勻,冷至45 ℃~50 ℃傾注平皿。
A.8 營養(yǎng)瓊脂斜面
A.8.1 成分
牛肉膏 3.0 g
蛋白胨 5.0 g
瓊脂 15.0 g
蒸餾水 1 000.0 mL
pH7.3±0.1
A.8.2 制法
將上述成分加于蒸餾水中,煮沸溶解,調(diào)節(jié)pH。分裝合適的試管,121 ℃高壓滅菌15 min。滅菌后擺
成斜面?zhèn)溆谩?br /> A.9 結(jié)晶紫中性紅膽鹽瓊脂(VRBA)
A.9.1 成分
蛋白胨 7.0 g
酵母膏 3.0 g
乳糖 10.0 g
氯化鈉 5.0 g
膽鹽或 3 號膽鹽 1.5 g
中性紅 0.03 g
結(jié)晶紫 0.002 g
瓊脂 15 g~18 g
蒸餾水 1 000.0 mL
GB 4789.38-2012
10
pH7.4±0.1
A.9.2 制法
將上述成分溶于蒸餾水中,靜置幾分鐘,充分?jǐn)嚢瑁{(diào)節(jié)pH。煮沸2 min,將培養(yǎng)基冷至45 ℃~50 ℃
傾注平板。使用前臨時制備,不得超過3 h。
A.10 結(jié)晶紫中性紅膽鹽-4-甲基傘形酮-β-D-葡萄糖苷瓊脂(VRBA-MUG)
A.10.1 成分
蛋白胨 7.0 g
酵母膏 3.0 g
乳糖 10.0 g
氯化鈉 5.0 g
膽鹽或 3 號膽鹽 1.5 g
中性紅 0.03 g
結(jié)晶紫 0.002 g
瓊脂 15 g~18 g
蒸餾水 1 000.0 mL
4-甲基傘形酮-β-D-葡萄糖苷(MUG) 0.1 g
pH7.4±0.1
A.10.2 制法
將上述成分溶于蒸餾水中,靜置幾分鐘,充分?jǐn)嚢�,調(diào)節(jié)pH。煮沸2 min,將培養(yǎng)基冷至45 ℃~50 ℃
使用。
A.11 革蘭氏染色液
A.11.1 結(jié)晶紫染色液
A.11.1.1 成分
結(jié)晶紫 1.0 g
95%乙醇 20.0 mL
1%草酸銨水溶液 80.0 mL
A.11.1.2 制法
將結(jié)晶紫完全溶解于乙醇中,然后與草酸銨溶液混合。
A.11.2 革蘭氏碘液
A.11.2.1 成分
碘 1.0 g
碘化鉀 2.0 g
蒸餾水 300.0 mL
A.11.2.2 制法
將碘與碘化鉀先行混合,加入少許蒸餾水充分振搖,待完全溶解后,再加蒸餾水至300 mL。
A.11.3 沙黃復(fù)染液
A.11.3.1 成分
沙黃 0.25 g
95%乙醇 10.0 mL
蒸餾水 90.0 mL
A.11.3.2 制法
將沙黃溶解于乙醇中,然后用蒸餾水稀釋。
A.11.4 染色法
GB 4789.38-2012
11
A.11.4.1 涂片在火焰上固定,滴加結(jié)晶紫染液,染1 min,水洗。
A.11.4.2 滴加革蘭氏碘液,作用1 min,水洗。
A.11.4.3 滴加95%乙醇脫色約15 s~30 s,直至染色液被洗掉,不要過分脫色,水洗。
A.11.4.4 滴加復(fù)染液,復(fù)染1 min,水洗、待干、鏡檢。
A.12 Kovacs 靛基質(zhì)試劑
A.12.1 成分
對二甲氨基苯甲醛 5.0 g
戊醇 75.0 mL
鹽酸(濃) 25.0 mL
A.12.2 制法
將對二甲氨基苯甲醛溶于戊醇中,然后慢慢加入濃鹽酸即可。
A.12.3 試驗方法
將培養(yǎng)物接種蛋白胨水,36 ℃±1 ℃培養(yǎng)24 h±2 h后,加Kovacs靛基質(zhì)試劑0.2 mL~0.3 mL,上層出
現(xiàn)紅色為靛基質(zhì)陽性反應(yīng)。
A.13 無菌 1mol/L NaOH:
A.13.1 成分
NaOH 40.0 g
蒸餾水 1 000.0 mL
A.13.2 制法:
稱取40 g氫氧化鈉溶于1000 mL蒸餾水中,121 ℃高壓滅菌15 min。
A.14 無菌 1 mol/L HCl:
A.14.1 成分
HCl 90.0 mL
蒸餾水 1 000.0 mL
A.14.2 制法
移取濃鹽酸90 mL,用蒸餾水稀釋至1000 mL,121 ℃高壓滅菌15 min。
GB 4789.38-2012
12
附錄B
大腸埃希氏菌最可能數(shù)(MPN)檢索表
每g(mL)檢樣中大腸埃希氏菌最可能數(shù)(MPN)的檢索見表B.1。
表 B.1 大腸埃希氏菌最可能數(shù)(MPN)檢索表
陽性管數(shù)
MPN
95%置信區(qū)間 陽性管數(shù)
MPN
95%置信區(qū)間
0.10 0.01 0.001 下限 上限 0.10 0.01 0.001 下限 上限
0
0
0
0
0
0
1
1
1
1
1
1
1
1
2
2
2
2
2
2
0
0
1
1
2
3
0
0
0
1
1
2
2
3
0
0
0
1
1
1
0
1
0
1
0
0
0
1
2
0
1
0
1
0
0
1
2
0
1
2
<3.0
3.0
3.0
6.1
6.2
9.4
3.6
7.2
11
7.4
11
11
15
16
9.2
14
20
15
20
27
-
0.15
0.15
1.2
1.2
3.6
0.17
1.3
3.6
1.3
3.6
3.
4.5
4.5
1.4
3.6
4.5
3.7
4.5
8.7
9.5
9.6
11
18
18
38
18
18
38
20
38
42
42
42
38
42
42
42
42
94
2
2
2
2
2
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
2
2
2
3
3
0
0
0
1
1
1
1
2
2
2
2
3
3
3
3
0
1
2
0
1
0
1
2
0
1
2
3
0
1
2
3
0
1
2
3
21
28
35
29
36
23
38
64
43
75
120
160
93
150
210
290
240
460
1100
>1100
4.5
8.7
8.7
8.7
8.7
4.6
8.7
17
9
17
37
40
18
37
40
90
42
90
180
420
42
94
94
94
94
94
110
180
180
200
420
420
420
420
430
1000
1000
2000
4100
—
注1:本表采用3個稀釋度[0.1g (mL)、0.01g (mL)和0.001g (mL)],每個稀釋接種3管。
注2:表內(nèi)所列檢樣量如改用1g (mL)、0.1g (mL)和0.01g(mL)時,表內(nèi)數(shù)字應(yīng)相應(yīng)降低10倍;如改用0.01g(mL)、0.001g
(mL)、0.0001g (mL)時,則表內(nèi)數(shù)字應(yīng)相應(yīng)增高10倍,其余類推。
GB 4789.38-2012
食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)
食品微生物學(xué)檢驗 大腸埃希氏菌計數(shù)
中 華 人 民 共 和 國 衛(wèi) 生 部
發(fā)布
2012-05-17 發(fā)布 2012-07-17 實施
GB 4789.38-2012
I
前 言
本標(biāo)準(zhǔn)代替 GB/T 4789.38-2008 《食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗 大腸桿菌計數(shù)》。
本標(biāo)準(zhǔn)與 GB/T 4789.38-2008 相比,主要變化如下:
——修改了標(biāo)準(zhǔn)的中文名稱;
——修改了培養(yǎng)基和試劑;
——將“第二法 大腸桿菌 VRB-MUG 平板計數(shù)法”改為“大腸埃希氏菌平板計數(shù)法(第二法)”;
——刪除了“第三法 大腸桿菌 Petrifilm TM 測試片計數(shù)法”;
——修改了附錄 A。
GB 4789.38-2012
1
食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)
食品微生物學(xué)檢驗 大腸埃希氏菌計數(shù)
1 范圍
本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了食品中大腸埃希氏菌(Escherichia coli)計數(shù)的方法。
本標(biāo)準(zhǔn)適用于食品中大腸埃希氏菌的計數(shù),其中大腸埃希氏菌平板計數(shù)法(第二法)不適用于貝類產(chǎn)
品。
2 術(shù)語和定義
2.1 大腸埃希氏菌 Escherichia coli
大腸桿菌
廣泛存在于人和溫血動物的腸道中,能夠在44.5℃發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣,IMViC(靛基質(zhì)、甲基紅、VP
試驗、檸檬酸鹽)生化試驗為++--或-+--的革蘭氏陰性桿菌。以此作為糞便污染指標(biāo)來評價食品
的衛(wèi)生狀況,推斷食品中腸道致病菌污染的可能性。
2.2 最可能數(shù)
基于泊松分布的一種間接計數(shù)方法,簡稱為MPN。
3 設(shè)備和材料
除微生物實驗室常規(guī)滅菌及培養(yǎng)設(shè)備外,其他設(shè)備和材料如下:
a) 恒溫培養(yǎng)箱:36 ℃±1 ℃;
b) 冰箱:2 ℃~5 ℃;
c) 恒溫水浴箱:44.5 ℃±0.2 ℃;
d) 天平:感量為 0.1 g;
c) 均質(zhì)器;
d) 振蕩器;
e) 無菌吸管:1 mL(具 0.01 mL 刻度)、10 mL(具 0.1 mL 刻度)或微量移液器及吸頭;
f) 無菌錐形瓶:容量 500 mL;
g) 無菌培養(yǎng)皿:直徑 90 mm;
h) pH 計或 pH 比色管或精密 pH 試紙;
i) 菌落計數(shù)器;
j) 紫外燈:波長 360 nm~366 nm,功率≤6 W。
4 培養(yǎng)基和試劑
4.1 月桂基硫酸鹽胰蛋白胨(LST)肉湯:見附錄 A 中 A.1。
4.2 EC 肉湯(E.coli broth):見附錄 A 中 A.2。
4.3 蛋白胨水:見附錄 A 中 A.3。
GB 4789.38-2012
2
4.4 緩沖葡萄糖蛋白胨水[甲基紅(MR)和 V-P 試驗用]:見附錄 A 中 A.4。
4.5 西蒙氏檸檬酸鹽培養(yǎng)基:見附錄 A 中 A.5。
4.6 磷酸鹽緩沖液:見附錄 A 中 A.6。
4.7 伊紅美藍(lán)(EMB)瓊脂:見附錄 A 中 A.7。
4.8 營養(yǎng)瓊脂斜面:見附錄 A 中 A.8。
4.9 結(jié)晶紫中性紅膽鹽瓊脂(VRBA):見附錄 A 中 A.9。
4.10 結(jié)晶紫中性紅膽鹽-4-甲基傘形酮-β-D-葡萄糖苷瓊脂(VRBA-MUG):見附錄 A 中 A.10。
4.11 革蘭氏染色液:見附錄 A 中 A.11。
4.12 Kovacs 靛基質(zhì)試劑:見附錄 A 中 A.12。
4.13 無菌 1 mol/L NaOH:見附錄 A 中 A.13。
4.14 無菌 1 mol/L HCl:見附錄 A 中 A.14。
GB 4789.38-2012
3
5 大腸埃希氏菌 MPN 計數(shù)(第一法)
5.1 檢驗程序
大腸埃希氏菌MPN計數(shù)的檢驗程序見圖1。
圖1 大腸埃希氏菌MPN計數(shù)法檢驗程序
不產(chǎn)氣
36℃±1℃ 18h~24h
36℃±1℃ 18h~24h
36℃±1℃ 48h±2h
44.5℃±0.2℃ 48 h±2 h
檢樣
25g(mL)樣品+ 225ml 稀釋液,均質(zhì)
10 倍系列稀釋
選擇適宜 3 個連續(xù)稀釋度的樣品勻液,接種 LST 肉湯管
產(chǎn)氣
EC 肉湯
不產(chǎn)氣 產(chǎn)氣
EMB 平板劃線
可疑菌落移種營養(yǎng)瓊脂斜面或平板
IMViC 生化試驗,革蘭氏染色
陰性管 陽性管
查 MPN 表
報 告
GB 4789.38-2012
4
5.2 操作步驟
5.2.1 樣品的稀釋
5.2.1.1 固體和半固體樣品:稱取 25 g 樣品,放入盛有 225 mL 磷酸鹽緩沖液的無菌均質(zhì)杯內(nèi),8 000
r/min~10 000 r/min 均質(zhì) 1 min~2 min,制成 1:10 樣品勻液,或放入盛有 225 mL 磷酸鹽緩沖液的無菌均質(zhì)
袋中,用拍擊式均質(zhì)器拍打 1 min~2 min 制成 1:10 的樣品勻液。
5.2.1.2 液體樣品:以無菌吸管吸取 25 mL 樣品置盛有 225 mL 磷酸鹽緩沖液的無菌錐形瓶(瓶內(nèi)預(yù)置適
當(dāng)數(shù)量的無菌玻璃珠)中,充分混勻,制成 1:10 的樣品勻液。
5.2.1.3 樣品勻液的 pH 值應(yīng)在 6.5~7.5 之間,必要時分別用 1 mol/L NaOH 或 1 mol/L HCl 調(diào)節(jié)。
5.2.1.4 用 1 mL 無菌吸管或微量移液器吸取 1:10 樣品勻液 1 mL,沿管壁緩緩注入 9 mL 磷酸鹽緩沖液
的無菌試管中(注意吸管或吸頭尖端不要觸及稀釋液面),振搖試管或換用 1 支 1 mL 無菌吸管或吸頭反復(fù)
吹打,使其混合均勻,制成 1:100 的樣品勻液。
5.2.1.5 根據(jù)對樣品污染狀況的估計,按上述操作,依次制成10倍遞增系列稀釋樣品勻液。每遞增稀釋1
次,換用1支1 mL無菌吸管或吸頭。從制備樣品勻液至樣品接種完畢,全過程不得超過15 min。
5.2.2 初發(fā)酵試驗
每個樣品,選擇 3 個適宜的連續(xù)稀釋度的樣品勻液(液體樣品可以選擇原液),每個稀釋度接種 3 管
月桂基硫酸鹽胰蛋白胨(LST)肉湯,每管接種 1 mL(如接種量超過 1 mL,則用雙料 LST 肉湯),36 ℃±1 ℃
培養(yǎng)24 h±2 h,觀察小倒管內(nèi)是否有氣泡產(chǎn)生,24 h±2 h產(chǎn)氣者進(jìn)行復(fù)發(fā)酵試驗,如未產(chǎn)氣則繼續(xù)培養(yǎng)48 h±2
h。產(chǎn)氣者進(jìn)行復(fù)發(fā)酵試驗。如所有 LST 肉湯管均未產(chǎn)氣,即可報告大腸埃希氏菌 MPN 結(jié)果。
5.2.3 復(fù)發(fā)酵試驗
用接種環(huán)從產(chǎn)氣的 LST 肉湯管中分別取培養(yǎng)物 1 環(huán),移種于已提前預(yù)溫至 45 ℃的 EC 肉湯管中,放
入帶蓋的 44.5 ℃±0.2 ℃水浴箱內(nèi)。水浴的水面應(yīng)高于肉湯培養(yǎng)基液面,培養(yǎng) 24 h±2 h,檢查小倒管內(nèi)是否
有氣泡產(chǎn)生,如未有產(chǎn)氣則繼續(xù)培養(yǎng)至 48 h±2 h。記錄在 24 h 和 48 h 內(nèi)產(chǎn)氣的 EC 肉湯管數(shù)。如所有 EC
肉湯管均未產(chǎn)氣,即可報告大腸埃希氏菌 MPN 結(jié)果;如有產(chǎn)氣者,則進(jìn)行 EMB 平板分離培養(yǎng)。
5.2.4 伊紅美藍(lán)平板分離培養(yǎng)
輕輕振搖各產(chǎn)氣管,用接種環(huán)取培養(yǎng)物分別劃線接種于 EMB 平板,36 ℃±1 ℃培養(yǎng) 18 h~24 h。觀察
平板上有無具黑色中心有光澤或無光澤的典型菌落。
5.2.5 營養(yǎng)瓊脂斜面或平板培養(yǎng)
從每個平板上挑 5 個典型菌落,如無典型菌落則挑取可疑菌落。用接種針接觸菌落中心部位,移種到
營養(yǎng)瓊脂斜面或平板上,36 ℃±1 ℃,培養(yǎng) 18 h~24 h。取培養(yǎng)物進(jìn)行革蘭氏染色和生化試驗。
5.2.6 鑒定
取培養(yǎng)物進(jìn)行靛基質(zhì)試驗、MR-VP 試驗和檸檬酸鹽利用試驗。大腸埃希氏菌與非大腸埃希氏菌的生
化鑒別見表 1。
GB 4789.38-2012
5
表 1 大腸埃希氏菌與非大腸埃希氏菌的生化鑒別
靛基質(zhì)(I) 甲基紅(MR) VP試驗(VP) 檸檬酸鹽(C) 鑒定(型別)
+
-
+
+
-
-
-
-
典型大腸埃希氏菌
非典型大腸埃希氏菌
+
-
+
+
-
-
+
+
典型中間型
非典型中間型
-
+
-
-
+
+
+
+
典型產(chǎn)氣腸桿菌
非典型產(chǎn)氣腸桿菌
注1:如出現(xiàn)表1以外的生化反應(yīng)類型,表明培養(yǎng)物可能不純,應(yīng)重新劃線分離,必要時做重復(fù)試驗。
注2:生化試驗也可以選用生化鑒定試劑盒或全自動微生物生化鑒定系統(tǒng)等方法,按照產(chǎn)品說明書進(jìn)行操作。
5.3 大腸埃希氏菌 MPN 計數(shù)的報告
大腸埃希氏菌為革蘭氏陰性無芽胞桿菌,發(fā)酵乳糖、產(chǎn)酸、產(chǎn)氣,IMViC 生化試驗為++――或-+
--。只要有 1 個菌落鑒定為大腸埃希氏菌,其所代表的 LST 肉湯管即為大腸埃希氏菌陽性。依據(jù) LST
肉湯陽性管數(shù)查 MPN 表(見附錄 B),報告每 g(mL)樣品中大腸埃希氏菌 MPN 值。
6 大腸埃希氏菌平板計數(shù)法(第二法)
6.1 檢驗程序
大腸埃希氏菌平板計數(shù)法的檢驗程序見圖2。
圖 2 大腸埃希氏菌平板計數(shù)法檢驗程序
6.2 操作步驟
6.2.1 樣品的稀釋
按5.2.1進(jìn)行。
6.2.2 平板計數(shù)
檢樣
25g(ml)樣品+225ml 稀釋液,均質(zhì)
選擇 2 個~3 個適宜連續(xù)稀釋度的樣品勻液,接種 VRBA-MUG 平板
10 倍系列稀釋
紫外燈照射,計數(shù)發(fā)熒光菌落
報告結(jié)果
36 ℃±1 ℃ 18 h~24 h
GB 4789.38-2012
6
6.2.2.1 選取 2 個~3 個適宜的連續(xù)稀釋度的樣品勻液,每個稀釋度接種 2 個無菌平皿,每皿 1 mL。同時
取 1 mL 稀釋液加入無菌平皿做空白對照。
6.2.2.2 將10 mL~15 mL 冷至45 ℃±0.5 ℃的結(jié)晶紫中性紅膽鹽瓊脂(VRBA)傾注于每個平皿中。小心
旋轉(zhuǎn)平皿,將培養(yǎng)基與樣品勻液充分混勻。待瓊脂凝固后,再加3 mL~4 mL VRBA-MUG覆蓋平板表層。
凝固后翻轉(zhuǎn)平板,36 ℃±1 ℃培養(yǎng)18 h~24 h。
6.3 平板菌落數(shù)的選擇
選擇菌落數(shù)在10 CFU~100 CFU之間的平板,暗室中360 nm~366 nm 波長紫外燈照射下,計數(shù)平板
上發(fā)淺藍(lán)色熒光的菌落。
檢驗時用已知MUG陽性菌株(如大腸埃希氏菌 ATCC 25922)和產(chǎn)氣腸桿菌(如ATCC 13048)做陽
性和陰性對照。
6.4 大腸埃希氏菌平板計數(shù)的報告
兩個平板上發(fā)熒光菌落數(shù)的平均數(shù)乘以稀釋倍數(shù),報告每g (mL)樣品中大腸埃希氏菌數(shù),以CFU/g (mL)
表示。若所有稀釋度(包括液體樣品原液)平板均無菌落生長,則以小于1乘以最低稀釋倍數(shù)報告。
GB 4789.38-2012
7
附錄A
培養(yǎng)基和試劑
A.1 月桂基硫酸鹽胰蛋白胨(LST)肉湯
A.1.1 成分
胰蛋白胨或胰酪胨 20.0 g
氯化鈉 5.0 g
乳糖 5.0 g
磷酸氫二鉀(K 2 HPO 4 ) 2.75 g
磷酸二氫鉀(KH 2 PO 4 ) 2.75 g
月桂基硫酸鈉 0.1 g
蒸餾水 1 000 .0mL
pH6.8±0.2
A.1.2 制法
將上述成分溶解于蒸餾水中,調(diào)節(jié)pH。分裝到有玻璃小倒管的試管中,每管10 mL。121 ℃高壓滅菌 15
min。
制備雙料 LST 肉湯時,除蒸餾水外其他成分加倍。
A.2 EC 肉湯( E.coli broth)
A.2.1 成分
胰蛋白胨或胰酪胨 20.0 g
3 號膽鹽或混合膽鹽 1.5g
乳糖 5.0 g
磷酸氫二鉀(K 2 HPO 4 ) 4.0 g
磷酸二氫鉀(KH 2 PO 4 ) 1.5 g
氯化鈉 5.0 g
蒸餾水 1 000.0 mL
pH6.9±0.1
A.2.2 制法
將上述成分溶解于蒸餾水中,調(diào)節(jié)pH,分裝到有玻璃小倒管的試管中,每管8 mL。121 ℃高壓滅菌15
min。
A.3 蛋白胨水
A.3.1 成分
胰胨或胰酪胨 10.0 g
蒸餾水 1 000.0 mL
pH6.9±0.2
A.3.2 制法
加熱攪拌溶解胰胨或胰酪胨于蒸餾水中。分裝試管,每管5 mL。121 ℃高壓滅菌15 min。
A.4 緩沖葡萄糖蛋白胨水[甲基紅(MR)和 V-P 試驗用]
A.4.1 成分
多胨 7.0 g
GB 4789.38-2012
8
葡萄糖 5.0 g
磷酸氫二鉀(K 2 HPO 4 ) 5.0 g
蒸餾水 1 000.0 mL
pH7.0
A.4.2 制法
將上述成分溶解于蒸餾水中,調(diào)節(jié)pH,分裝試管,每管1 mL,121 ℃高壓滅菌15 min,備用。
A.4.3 甲基紅(MR)試驗
A.4.3.1 甲基紅試劑
A.4.3.1.1 成分
甲基紅 10 mg
95%乙醇 30.0 mL
蒸餾水 20.0 mL
A.4.3.1.2 制法
10 mg甲基紅溶于30 mL95%乙醇中,然后加入20 mL蒸餾水。
A.4.3.1.3 試驗方法
取適量瓊脂培養(yǎng)物接種于緩沖葡萄糖蛋白胨水,36 ℃±1 ℃培養(yǎng)2 d~5 d。滴加甲基紅試劑一滴,立
即觀察結(jié)果。鮮紅色為陽性,黃色為陰性。
A.4.4 V-P 試驗
A.4.4.1 6%α-萘酚-乙醇溶液
成分及制法:取α-萘酚6.0 g,加無水乙醇溶解,定容至100 mL。
A.4.4.2 40%氫氧化鉀溶液
成分及制法:取氫氧化鉀40 g,加蒸餾水溶解,定容至100 mL。
A.4.4.3 試驗方法
取適量瓊脂培養(yǎng)物接種于緩沖葡萄糖蛋白胨水,36 ℃±1 ℃培養(yǎng)2 d~4 d。加入6% α-萘酚-乙醇溶液0.5
mL和40 %氫氧化鉀溶液0.2 mL,充分振搖試管,觀察結(jié)果。陽性反應(yīng)立刻或于數(shù)分鐘內(nèi)出現(xiàn)紅色,如為陰
性,應(yīng)放在36 ℃±1 ℃繼續(xù)培養(yǎng)4 h 再進(jìn)行觀察。
A.5 西蒙氏檸檬酸鹽培養(yǎng)基
A.5.1 成分
檸檬酸鈉 2.0 g
氯化鈉 5.0 g
磷酸氫二鉀 1.0 g
磷酸二氫銨 1.0 g
硫酸鎂 0.2 g
溴百里香酚藍(lán) 0.08 g
瓊脂 8.0 g~18.0g
蒸餾水 1 000.0 mL
pH 6.8±0.2
A.5.2 制法
將各成分加熱溶解,必要時調(diào)節(jié) pH。每管分裝 10 mL,121 ℃高壓 15 min,制成斜面。
A.5.3 實驗方法
挑取培養(yǎng)物接種于整個培養(yǎng)基斜面,36 ℃±1 ℃培養(yǎng)24 h±2 h,觀察結(jié)果。陽性者培養(yǎng)基變?yōu)樗{(lán)色。
A.6 磷酸鹽緩沖液
A.6.1 成分
GB 4789.38-2012
9
磷酸二氫鉀(KH 2 PO 4 ) 34.0g
蒸餾水 500.0 mL
pH7.2
A.6.2 制法
貯存液:稱取34.0 g的磷酸二氫鉀溶于500 mL蒸餾水中,用大約175 mL的1 mol/L氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH,用
蒸餾水稀釋至1000 mL后貯存于冰箱。
稀釋液:取貯存液1.25 mL,用蒸餾水稀釋至1 000 mL,分裝于適宜容器中,121 ℃高壓滅菌15 min。
A.7 伊紅美藍(lán)(EMB)瓊脂
A.7.1 成分
蛋白胨 10.0 g
乳糖 10.0 g
磷酸氫二鉀(K 2 HPO 4 ) 2.0 g
瓊脂 15.0 g
伊紅γ(水溶液) 0.4 g或2%水溶液20.0 mL
美藍(lán) 0.065 g或0.5%水溶液13.0 mL
蒸餾水 1 000.0 mL
pH7.1±0.2
A.7.2 制法
在1 000 mL蒸餾水中煮沸溶解蛋白胨、磷酸鹽和瓊脂,加水補(bǔ)足。分裝于三角燒瓶中。每瓶100 mL或
200 mL,調(diào)節(jié)pH,121 ℃高壓滅菌15 min。使用前將瓊脂融化,于每100 mL瓊脂中加5 mL滅菌的20%乳糖
溶液,2 mL的2%的伊紅γ水溶液和1.3 mL 0.5%的美藍(lán)水溶液,搖勻,冷至45 ℃~50 ℃傾注平皿。
A.8 營養(yǎng)瓊脂斜面
A.8.1 成分
牛肉膏 3.0 g
蛋白胨 5.0 g
瓊脂 15.0 g
蒸餾水 1 000.0 mL
pH7.3±0.1
A.8.2 制法
將上述成分加于蒸餾水中,煮沸溶解,調(diào)節(jié)pH。分裝合適的試管,121 ℃高壓滅菌15 min。滅菌后擺
成斜面?zhèn)溆谩?br /> A.9 結(jié)晶紫中性紅膽鹽瓊脂(VRBA)
A.9.1 成分
蛋白胨 7.0 g
酵母膏 3.0 g
乳糖 10.0 g
氯化鈉 5.0 g
膽鹽或 3 號膽鹽 1.5 g
中性紅 0.03 g
結(jié)晶紫 0.002 g
瓊脂 15 g~18 g
蒸餾水 1 000.0 mL
GB 4789.38-2012
10
pH7.4±0.1
A.9.2 制法
將上述成分溶于蒸餾水中,靜置幾分鐘,充分?jǐn)嚢瑁{(diào)節(jié)pH。煮沸2 min,將培養(yǎng)基冷至45 ℃~50 ℃
傾注平板。使用前臨時制備,不得超過3 h。
A.10 結(jié)晶紫中性紅膽鹽-4-甲基傘形酮-β-D-葡萄糖苷瓊脂(VRBA-MUG)
A.10.1 成分
蛋白胨 7.0 g
酵母膏 3.0 g
乳糖 10.0 g
氯化鈉 5.0 g
膽鹽或 3 號膽鹽 1.5 g
中性紅 0.03 g
結(jié)晶紫 0.002 g
瓊脂 15 g~18 g
蒸餾水 1 000.0 mL
4-甲基傘形酮-β-D-葡萄糖苷(MUG) 0.1 g
pH7.4±0.1
A.10.2 制法
將上述成分溶于蒸餾水中,靜置幾分鐘,充分?jǐn)嚢�,調(diào)節(jié)pH。煮沸2 min,將培養(yǎng)基冷至45 ℃~50 ℃
使用。
A.11 革蘭氏染色液
A.11.1 結(jié)晶紫染色液
A.11.1.1 成分
結(jié)晶紫 1.0 g
95%乙醇 20.0 mL
1%草酸銨水溶液 80.0 mL
A.11.1.2 制法
將結(jié)晶紫完全溶解于乙醇中,然后與草酸銨溶液混合。
A.11.2 革蘭氏碘液
A.11.2.1 成分
碘 1.0 g
碘化鉀 2.0 g
蒸餾水 300.0 mL
A.11.2.2 制法
將碘與碘化鉀先行混合,加入少許蒸餾水充分振搖,待完全溶解后,再加蒸餾水至300 mL。
A.11.3 沙黃復(fù)染液
A.11.3.1 成分
沙黃 0.25 g
95%乙醇 10.0 mL
蒸餾水 90.0 mL
A.11.3.2 制法
將沙黃溶解于乙醇中,然后用蒸餾水稀釋。
A.11.4 染色法
GB 4789.38-2012
11
A.11.4.1 涂片在火焰上固定,滴加結(jié)晶紫染液,染1 min,水洗。
A.11.4.2 滴加革蘭氏碘液,作用1 min,水洗。
A.11.4.3 滴加95%乙醇脫色約15 s~30 s,直至染色液被洗掉,不要過分脫色,水洗。
A.11.4.4 滴加復(fù)染液,復(fù)染1 min,水洗、待干、鏡檢。
A.12 Kovacs 靛基質(zhì)試劑
A.12.1 成分
對二甲氨基苯甲醛 5.0 g
戊醇 75.0 mL
鹽酸(濃) 25.0 mL
A.12.2 制法
將對二甲氨基苯甲醛溶于戊醇中,然后慢慢加入濃鹽酸即可。
A.12.3 試驗方法
將培養(yǎng)物接種蛋白胨水,36 ℃±1 ℃培養(yǎng)24 h±2 h后,加Kovacs靛基質(zhì)試劑0.2 mL~0.3 mL,上層出
現(xiàn)紅色為靛基質(zhì)陽性反應(yīng)。
A.13 無菌 1mol/L NaOH:
A.13.1 成分
NaOH 40.0 g
蒸餾水 1 000.0 mL
A.13.2 制法:
稱取40 g氫氧化鈉溶于1000 mL蒸餾水中,121 ℃高壓滅菌15 min。
A.14 無菌 1 mol/L HCl:
A.14.1 成分
HCl 90.0 mL
蒸餾水 1 000.0 mL
A.14.2 制法
移取濃鹽酸90 mL,用蒸餾水稀釋至1000 mL,121 ℃高壓滅菌15 min。
GB 4789.38-2012
12
附錄B
大腸埃希氏菌最可能數(shù)(MPN)檢索表
每g(mL)檢樣中大腸埃希氏菌最可能數(shù)(MPN)的檢索見表B.1。
表 B.1 大腸埃希氏菌最可能數(shù)(MPN)檢索表
陽性管數(shù)
MPN
95%置信區(qū)間 陽性管數(shù)
MPN
95%置信區(qū)間
0.10 0.01 0.001 下限 上限 0.10 0.01 0.001 下限 上限
0
0
0
0
0
0
1
1
1
1
1
1
1
1
2
2
2
2
2
2
0
0
1
1
2
3
0
0
0
1
1
2
2
3
0
0
0
1
1
1
0
1
0
1
0
0
0
1
2
0
1
0
1
0
0
1
2
0
1
2
<3.0
3.0
3.0
6.1
6.2
9.4
3.6
7.2
11
7.4
11
11
15
16
9.2
14
20
15
20
27
-
0.15
0.15
1.2
1.2
3.6
0.17
1.3
3.6
1.3
3.6
3.
4.5
4.5
1.4
3.6
4.5
3.7
4.5
8.7
9.5
9.6
11
18
18
38
18
18
38
20
38
42
42
42
38
42
42
42
42
94
2
2
2
2
2
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
2
2
2
3
3
0
0
0
1
1
1
1
2
2
2
2
3
3
3
3
0
1
2
0
1
0
1
2
0
1
2
3
0
1
2
3
0
1
2
3
21
28
35
29
36
23
38
64
43
75
120
160
93
150
210
290
240
460
1100
>1100
4.5
8.7
8.7
8.7
8.7
4.6
8.7
17
9
17
37
40
18
37
40
90
42
90
180
420
42
94
94
94
94
94
110
180
180
200
420
420
420
420
430
1000
1000
2000
4100
—
注1:本表采用3個稀釋度[0.1g (mL)、0.01g (mL)和0.001g (mL)],每個稀釋接種3管。
注2:表內(nèi)所列檢樣量如改用1g (mL)、0.1g (mL)和0.01g(mL)時,表內(nèi)數(shù)字應(yīng)相應(yīng)降低10倍;如改用0.01g(mL)、0.001g
(mL)、0.0001g (mL)時,則表內(nèi)數(shù)字應(yīng)相應(yīng)增高10倍,其余類推。