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中 華 人 民 共 和 國(guó) 國(guó) 家 標(biāo) 準(zhǔn)
GB4789. 36 — 2016
食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)
食品微生物學(xué)檢驗(yàn)
大腸埃希氏菌 O157 :
H7
/
NM
檢驗(yàn)
2016-12-23 發(fā)布 2017-06-23 實(shí)施
中華人民共和國(guó)國(guó)家衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì)
國(guó) 家 食 品 藥 品 監(jiān) 督 管 理 總 局
發(fā) 布
GB4789. 36 — 2016
Ⅰ
前 言
本標(biāo)準(zhǔn)代替 GB / T4789. 36 — 2008 《食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn) 大腸埃希氏菌 O157 : H7 / NM 檢驗(yàn)》。
本標(biāo)準(zhǔn)與 GB / T4789.
36 — 2008 相比,主要變化如下:
———標(biāo)準(zhǔn)名稱修改為“食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 大腸埃希氏菌 O157 : H7 / NM 檢驗(yàn)”;
———修改了標(biāo)準(zhǔn)的范圍;
———修改了設(shè)備和材料;
———修改了培養(yǎng)基和生化反應(yīng)的文字描述;
———?jiǎng)h除“第二法 免疫磁珠捕獲法的原理”;
———?jiǎng)h除“第三法 全自動(dòng)酶聯(lián)熒光免疫分析儀篩選法”;
———?jiǎng)h除“第四法 全自動(dòng)病原菌檢測(cè)系統(tǒng)篩選法”。
GB4789. 36 — 2016
1
食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)
食品微生物學(xué)檢驗(yàn)
大腸埃希氏菌 O157 :
H7
/ NM 檢驗(yàn)
1  范圍
本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了食品中大腸埃希氏菌 O157 : H7 / NM ( Escherichiacoli O157 : H7 / NM )的檢驗(yàn)方法。
本標(biāo)準(zhǔn)適用于食品中大腸埃希氏菌 O157 : H7 / NM 的檢驗(yàn)。
2  設(shè)備和材料
除微生物實(shí)驗(yàn)室常規(guī)滅菌及培養(yǎng)設(shè)備外,其他設(shè)備和材料如下:
2. 1  恒溫培養(yǎng)箱: 36℃±1℃ 。
2. 2  冰箱: 2℃~5℃ 。
2. 3  恒溫水浴箱: 46℃±1℃ 。
2. 4  天平:感量 0. 1g 、 0. 01g 。
2. 5  均質(zhì)器。
2. 6  顯微鏡: 10 倍 ~100 倍。
2. 7  無(wú)菌吸管: 1mL (具 0. 01mL 刻度)、 10mL (具 0. 1mL 刻度)或移液器及吸頭。
2. 8  無(wú)菌均質(zhì)杯或無(wú)菌均質(zhì)袋:容量 500mL 。
2. 9  無(wú)菌培養(yǎng)皿:直徑 90mm 。
2. 10 pH 計(jì)或精密
pH 試紙。
2. 11  長(zhǎng)波紫外光燈: 365nm ,功率 ≤6W 。
2. 12  微量離心管: 1. 5mL 或 2. 0mL 。
2. 13  磁板、磁板架、樣品混合器。
2. 14  微生物鑒定系統(tǒng)。
3  培養(yǎng)基和試劑
3. 1  改良 EC 肉湯( mEC+n ):見(jiàn) A. 1 。
3. 2  改良山梨醇麥康凱瓊脂( CT-SMAC ):見(jiàn) A. 2 。
3. 3  三糖鐵瓊脂( TSI ):見(jiàn) A. 3 。
3. 4  營(yíng)養(yǎng)瓊脂:見(jiàn) A. 4 。
3. 5  半固體瓊脂:見(jiàn) A. 5 。
3. 6  月桂基硫酸鹽胰蛋白胨肉湯 -MUG ( MUG-LST ):見(jiàn) A. 6 。
3. 7  氧化酶試劑:見(jiàn) A. 7 。
3. 8  革蘭氏染色液:見(jiàn) A. 8 。
3. 9 PBS-Tween20 洗液:見(jiàn) A. 9 。
3. 10  亞碲酸鉀( AR 級(jí))。
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2
3. 11  頭孢克肟( Cefixime )。
3. 12  大腸埃希氏菌 O157 顯色培養(yǎng)基。
3. 13  大腸埃希氏菌 O157 和 H7 診斷血清或 O157 乳膠凝集試劑。
3. 14  鑒定試劑盒。
3. 15  抗 - E . coli O157 免疫磁珠。
第一法 常規(guī)培養(yǎng)法
4  檢驗(yàn)程序
大腸埃希氏菌 O157 : H7 / NM 常規(guī)培養(yǎng)法檢驗(yàn)程序見(jiàn)圖 1 。
圖 1  大腸埃希氏菌 O157 : H7 / NM 常規(guī)培養(yǎng)法檢驗(yàn)程序
5  操作步驟
5. 1  增菌
以無(wú)菌操作取檢樣 25g (或 25mL )加入到含有 225mLmEC+n 肉湯的均質(zhì)袋中,在拍擊式均質(zhì)
器上連續(xù) 均 質(zhì) 1 min~2 min ;或 放 入 盛 有 225 mL mEC+n 肉 湯 的 均 質(zhì) 杯 中, 8000r / min~
10000r / min 均質(zhì) 1min~2min 。 36℃±1℃ 培養(yǎng) 18h~24h 。
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5. 2  分離
取增菌后的 mEC+n 肉湯,劃線接種于 CT-SMAC 平板和大腸埃希氏菌 O157 顯色瓊脂平板上,
36℃±1℃ 培養(yǎng) 18h~24h ,觀察菌落形態(tài)。在 CT-SMAC 平板上,典型菌落為圓形、光滑、較小的無(wú)色
菌落,中心呈現(xiàn)較暗的灰褐色;在大腸埃希氏菌 O157 顯色瓊脂平板上的菌落特征按產(chǎn)品說(shuō)明書進(jìn)行
判定。
5. 3  初步生化試驗(yàn)
在 CT-SMAC 和大腸埃希氏菌 O157 顯色瓊脂平板上分別挑取 5 個(gè) ~10 個(gè)可疑菌落,分別接種
TSI 瓊脂,同時(shí)接種 MUG-LST 肉湯,并用大腸埃希氏菌株( ATCC25922 或等效標(biāo)準(zhǔn)菌株)做陽(yáng)性對(duì)照
和大腸埃希氏菌 O157 : H7 ( NCTC12900 或等效標(biāo)準(zhǔn)菌株)做陰性對(duì)照,于 36 ℃±1 ℃ 培養(yǎng) 18h~
24h 。必要時(shí)進(jìn)行氧化酶試驗(yàn)和革蘭氏染色。在 TSI 瓊脂中,典型菌株為斜面與底層均呈黃色,產(chǎn)氣或
不產(chǎn)氣,不產(chǎn)生硫化氫( H 2 S )。置 MUG-LST 肉湯管于長(zhǎng)波紫外燈下觀察,
MUG 陽(yáng)性的大腸埃希氏菌
株應(yīng)有熒光產(chǎn)生, MUG 陰性的應(yīng)無(wú)熒光產(chǎn)生,大腸埃希氏菌 O157 :
H7 / NM 為 MUG 試驗(yàn)陰性,無(wú)熒
光。挑取可疑菌落,在營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上分純,于 36℃±1℃ 培養(yǎng) 18h~24h ,并進(jìn)行下列鑒定。
5. 4  鑒定
5. 4. 1  血清學(xué)試驗(yàn)
在營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上挑取分純的菌落,用 O157 和 H7 診斷血清或 O157 乳膠凝集試劑作玻片凝集試
驗(yàn)。對(duì)于 H7 因子血清不凝集者,應(yīng)穿刺接種半固體瓊脂,檢查動(dòng)力,經(jīng)連續(xù)傳代 3 次,動(dòng)力試驗(yàn)均陰
性,確定為無(wú)動(dòng)力株。如使用不同公司生產(chǎn)的診斷血清或乳膠凝集試劑,應(yīng)按照產(chǎn)品說(shuō)明書進(jìn)行。
5. 4. 2  生化試驗(yàn)
5. 4. 2. 1  自營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上挑取菌落,進(jìn)行生化試驗(yàn)。大腸埃希氏菌 O157 : H7 / NM 生化反應(yīng)特征見(jiàn)
表 1 。
表 1  大腸埃希氏菌 O157 : H7 / NM 生化反應(yīng)特征
生化試驗(yàn) 特征反應(yīng)
三糖鐵瓊脂 底層及斜面呈黃色, H 2 S 陰性
山梨醇 陰性或遲緩發(fā)酵
靛基質(zhì) 陽(yáng)性
甲基紅 - 伏普試驗(yàn)( MR-VP )
MR 陽(yáng)性, VP 陰性
氧化酶 陰性
西蒙氏檸檬酸鹽 陰性
賴氨酸脫羧酶 陽(yáng)性(紫色)
鳥氨酸脫羧酶 陽(yáng)性(紫色)
纖維二糖發(fā)酵 陰性
棉子糖發(fā)酵 陽(yáng)性
MUG 試驗(yàn)
陰性(無(wú)熒光)
動(dòng)力試驗(yàn) 有動(dòng)力或無(wú)動(dòng)力
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5. 4. 2. 2  如選擇生化鑒定試劑盒或微生物鑒定系統(tǒng),應(yīng)從營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上挑取菌落,用稀釋液制備成濁
度適當(dāng)?shù)木鷳乙?使用生化鑒定試劑盒或微生物鑒定系統(tǒng)進(jìn)行鑒定。
5. 4. 3  毒力基因測(cè)定(可選項(xiàng)目)
樣品中檢出大腸埃希氏菌 O157 : H7 或 O157 : NM 時(shí),如需要進(jìn)一步檢測(cè) Vero 細(xì)胞毒素基因的存
在,可通過(guò)接種 Vero 細(xì)胞或 HeLa 細(xì)胞,觀察細(xì)胞病變進(jìn)行判定;也可使用基因探針檢測(cè)或聚合酶鏈反
應(yīng)(
PCR )方法進(jìn)行志賀毒素基因( stx 1 、 stx 2 )、 eae 、
hly
等基因的檢測(cè)。如使用試劑盒檢測(cè)上述基因,應(yīng)
按照產(chǎn)品的說(shuō)明書進(jìn)行。
6  結(jié)果報(bào)告
綜合生化和血清學(xué)試驗(yàn)結(jié)果,報(bào)告 25g (或 25mL )樣品中檢出或未檢出大腸埃希氏菌 O157 : H7
或大腸埃希氏菌 O157 : NM 。
第二法 免疫磁珠捕獲法
7  檢驗(yàn)程序
大腸埃希氏菌 O157 : H7 / NM 免疫磁珠捕獲法檢驗(yàn)程序見(jiàn)圖 2 。
圖 2  大腸埃希氏菌 O157 : H7 / NM 免疫磁珠捕獲法檢驗(yàn)程序
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8  操作步驟
8. 1  增菌
同 5.
1 。
8. 2  免疫磁珠捕獲與分離
8. 2. 1  應(yīng)按照生產(chǎn)商提供的使用說(shuō)明進(jìn)行免疫磁珠捕獲與分離。當(dāng)生產(chǎn)商的使用說(shuō)明與下面的描述
可能有偏差時(shí),按生產(chǎn)商提供的使用說(shuō)明進(jìn)行。
8. 2. 2  將微量離心管按樣品和質(zhì)控菌株進(jìn)行編號(hào),每個(gè)樣品使用 1 只微量離心管,然后插入到磁板架
上。在漩渦混合器上輕輕振蕩 E .
coli O157 免疫磁珠混懸液后,用開(kāi)蓋器打開(kāi)每個(gè)微量離心管的蓋子,
每管加入 20 μ L E . coli O157 免疫磁珠懸液。
8. 2. 3  取 mEC+n 肉湯增菌培養(yǎng)物 1mL ,加入到微量離心管中,蓋上蓋子,然后輕微振蕩 10s 。每個(gè)
樣品更換 1 只加樣吸頭,質(zhì)控菌株必須與樣品分開(kāi)進(jìn)行,避免交叉污染。
8. 2. 4  結(jié)合:在 18℃~30℃ 環(huán)境中,將上述微量離心管連同磁板架放在樣品混合器上轉(zhuǎn)動(dòng)或用手輕微
轉(zhuǎn)動(dòng) 10min ,使 E . coli O157 與免疫磁珠充分接觸。
8. 2. 5  捕獲:將磁板插入到磁板架中濃縮磁珠。在 3min 內(nèi)不斷地傾斜磁板架,確保懸液中與蓋子上的
免疫磁珠全部被收集起來(lái)。此時(shí),在微量離心管壁中間明顯可見(jiàn)圓形或橢圓形棕色聚集物。
8. 2. 6  吸取上清液:取 1 支無(wú)菌加長(zhǎng)吸管,從免疫磁珠聚集物對(duì)側(cè)深入液面,輕輕吸走上清液。當(dāng)吸到
液面通過(guò)免疫磁珠聚集物時(shí),應(yīng)放慢速度,以確保免疫磁珠不被吸走。如吸取的上清液內(nèi)含有磁珠,則
應(yīng)將其放回到微量離心管中,并重復(fù) 8.
2. 5 步驟。每個(gè)樣品換用 1 支無(wú)菌加長(zhǎng)吸管。
免疫磁珠的滑落:某些樣品特別是那些富含脂肪的樣品,其磁珠聚集物易于滑落到管底。在吸取上
清液時(shí),很難做到不丟失磁珠,在這種情況下,可保留 50 μ L~100 μ L 上清液于微量離心管中。如果在
后續(xù)的洗滌過(guò)程中也這樣做的話,脂肪的影響將減小,也可達(dá)到充分捕獲的目的。
8. 2. 7  洗滌:從磁板架上移走磁板,在每個(gè)微量離心管中加入 1mLPBS-Tween20 洗液,放在樣品混合
器上轉(zhuǎn)動(dòng)或用手輕微轉(zhuǎn)動(dòng) 3min ,洗滌免疫磁珠混合物。重復(fù)上述步驟 8.
2. 5~8. 2. 7 。
8. 2. 8  重復(fù)上述步驟 8. 2. 5~8. 2. 6 。
8. 2. 9  免疫磁珠懸浮:移走磁板,將免疫磁珠重新懸浮在 100 μ LPBS-Tween20 洗液中。
8. 2. 10  涂布平板:將免疫磁珠混勻,各取 50 μ L 免疫磁珠懸液分別轉(zhuǎn)移至 CT-SMAC 平板和大腸埃希
氏菌 O157 顯色瓊脂平板一側(cè),然后用無(wú)菌涂布棒將免疫磁珠涂布平板的一半,再用接種環(huán)劃線接種平
板的另一半。待瓊脂表面水分完全吸收后,翻轉(zhuǎn)平板,于 36℃±1℃ 培養(yǎng) 18h~24h 。
注:若 CT-SMAC 平板和大腸埃希氏菌 O157 顯色瓊脂平板表面水分過(guò)多時(shí),應(yīng)在 36 ℃±1 ℃ 下干燥 10min~
20min ,涂布時(shí)避免將免疫磁珠涂布到平板的邊緣。
8. 3  菌落識(shí)別
大腸埃希氏菌 O157 : H7 / NM 在 CT-SMAC 平板和大腸埃希氏菌 O157 顯色瓊脂平板上的菌落特
征同 5.
2 。
8. 4  初步生化試驗(yàn)
同 5.
3 。
8. 5  鑒定
同 5.
4 。
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9  結(jié)果報(bào)告
同第 6 章。
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附 錄 A
培養(yǎng)基和試劑
A. 1  改良 EC 肉湯( mEC+n )
A. 1. 1  成分
胰蛋白胨
20. 0g
3 號(hào)膽鹽 1. 12g
乳糖
5. 0g
K 2 HPO 4 · 7H 2 O 4. 0g
KH 2 PO 4 1. 5g
NaCl 5. 0g
新生霉素鈉鹽溶液(
20mg
/ mL )
1. 0mL
蒸餾水
1000mL
A. 1. 2  制法
除新生霉素外,所有成分溶解在水中,加熱煮沸,在 20℃~25℃ 下校正
pH
至 6.
9±0. 1 ,分裝。于
121℃ 高壓滅菌 15min ,備用。制備濃度為 20mg / mL 的新生霉素儲(chǔ)備溶液,過(guò)濾法除菌。待培養(yǎng)基溫
度冷至 50℃ 以下時(shí),按 1000mL 培養(yǎng)基內(nèi)加 1mL 新生霉素儲(chǔ)備液,使最終濃度為 20mg / L 。
A. 2  改良山梨醇麥康凱( CT-SMAC )瓊脂
A. 2. 1  山梨醇麥康凱( SMAC )瓊脂
A. 2. 1. 1  成分
蛋白胨
20. 0g
山梨醇
10. 0g
3 號(hào)膽鹽 1. 5g
氯化鈉
5. 0g
中性紅
0. 03g
結(jié)晶紫
0. 001g
瓊脂
15. 0g
蒸餾水
1000mL
A. 2. 1. 2  制法
除瓊脂、結(jié)晶紫和中性紅外,所有成分溶解在蒸餾水中,加熱煮沸,在 20 ℃~25 ℃ 下校正
pH
至
7. 2±0. 2 ,加入瓊脂、結(jié)晶紫和中性紅,煮沸溶解,分裝。于 121℃ 高壓滅菌 15min 。
A. 2. 2  亞碲酸鉀溶液
A. 2. 2. 1  成分
亞碲酸鉀
0. 5g
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蒸餾水
200mL
A. 2. 2. 2  制法
將亞碲酸鉀溶于水,過(guò)濾法除菌。
A. 2. 3  頭孢克肟( Cefixime )溶液
A. 2. 3. 1  成分
頭孢克肟
1. 0mg
95% 乙醇 200mL
A. 2. 3. 2  制法
將頭孢克肟溶解于 95% 乙醇中,靜置 1h 待其充分溶解后過(guò)濾除菌。分裝試管,儲(chǔ)存于 -20℃ ,有
效期 1 年。解凍后的頭孢克肟溶液不應(yīng)再凍存,且在 2℃~8℃ 下有效期 14d 。
A. 2. 4 CT-SMAC 制法
取 1000mL 滅菌融化并冷卻至 46℃±1℃ 的山梨醇麥康凱( SMAC )瓊脂,加入 1mL 亞碲酸鉀溶
液和 10mL 頭孢克肟溶液,使亞碲酸鉀濃度達(dá)到 2.
5mg
/ L ,頭孢克肟濃度達(dá)到 0.
05mg
/ L ,混勻后傾注
平板。
A. 3  三糖鐵瓊脂( TSI )
A. 3. 1  成分
蛋白胨
20. 0g
牛肉浸膏
5. 0g
乳糖
10. 0g
蔗糖
10. 0g
葡萄糖
1. 0g
硫酸亞鐵銨[( NH 4 )
2 Fe ( SO 4 ) 2 · 6H 2 O ] 0. 2g
氯化鈉
5. 0g
硫代硫酸鈉
0. 2g
酚紅
0. 025g 或 5. 0g / L 溶液 5. 0mL
瓊脂
12. 0g
蒸餾水
1000mL
A. 3. 2  制法
除酚紅和瓊脂外,將其他成分加于 400mL 蒸餾水中,煮沸溶解,在 20℃~25℃ 下校正
pH
至 7.
4
±0. 2 。另將瓊脂加于 600mL 蒸餾水中,煮沸溶解。
將上述兩溶液混合均勻后,加入 5% 酚紅水溶液 5mL ,混勻,分裝小號(hào)試管,每管約 2mL~4mL 。
于 121°C10min 或 115°C15min ,制成高層斜面。冷卻后呈桔紅色。如不立即使用,在 2℃~8℃ 條
件下可儲(chǔ)存一個(gè)月。
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A. 4  營(yíng)養(yǎng)瓊脂
A. 4. 1  成分
蛋白胨
10. 0g
牛肉膏
3. 0g
氯化鈉
5. 0g
瓊脂
15. 0g
蒸餾水
1000mL
A. 4. 2  制法
將各成分溶解于蒸餾水中,加熱煮沸至完全溶解,校正
pH
至 7.
4±0. 2 ,分裝。于 121 ℃ 高壓滅菌
15min 。
A. 5  半固體瓊脂
A. 5. 1  成分
蛋白胨
1. 0g
牛肉膏
0. 3g
氯化鈉
0. 5g
瓊脂
0. 3g~0. 4g
蒸餾水
100mL
A. 5. 2  制法
將各成分溶解于蒸餾水中,加熱煮沸至完全溶解,校正
pH
至 7.
4±0. 2 ,分裝小試管,于 121℃ 高壓
滅菌 15min 。直立凝固備用。
A. 6  月桂基硫酸鹽蛋白胨肉湯 -MUG ( LST-MUG )
A. 6. 1  成分
胰蛋白胨
20. 0g
氯化鈉
5. 0g
乳糖
5. 0g
磷酸氫二鉀 ( K
2 HPO 4 ) 2. 75g
磷酸二氫鉀( KH 2 PO 4 )
2. 75g
十二烷基硫酸鈉
0. 1g
4- 甲基傘形酮 -
β -D- 葡萄糖醛酸苷( MUG )
0. 1g
蒸餾水
1000mL
A. 6. 2  制法
將各成分溶解于蒸餾水中,加熱煮沸至完全溶解,于 20℃~25℃ 下校正
pH
至 6.
8±0. 2 ,分裝到帶
有倒管的試管中,每管 10mL ,于 121℃ 高壓滅菌 15min 。
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A. 7  氧化酶試劑
A. 7. 1  成分
N , N '- 二甲基對(duì)苯二胺鹽酸鹽
或 N , N , N' , N '- 四甲基對(duì)苯二胺鹽酸鹽
1. 0g
蒸餾水
100mL
A. 7. 2  制法
少量新鮮配制,于冰箱內(nèi)避光保存,在 7d 內(nèi)使用。
A. 7. 3  試驗(yàn)方法
用無(wú)菌棉拭子取單個(gè)菌落,滴加氧化酶試劑,
10s 內(nèi)呈現(xiàn)粉紅或紫紅色,即為氧化酶試驗(yàn)陽(yáng)性。不
變色者為氧化酶試驗(yàn)陰性。
A. 8  革蘭氏染色液
A. 8. 1  結(jié)晶紫染色液
A. 8. 1. 1  成分
結(jié)晶紫
1. 0g
95% 乙醇 20mL
1% 草酸銨水溶液 80mL
A. 8. 1. 2  制法
將結(jié)晶紫完全溶解于乙醇中,然后與草酸銨溶液混合。
A. 8. 2  革蘭氏碘液
A. 8. 2. 1  成分
碘
1. 0g
碘化鉀
2. 0g
蒸餾水
300mL
A. 8. 2. 2  制法
將碘與碘化鉀先行混合,加入蒸餾水少許充分振搖,待完全溶解后,再加蒸餾水至 300mL 。
A. 8. 3  沙黃復(fù)染液
A. 8. 3. 1  成分
沙黃
0. 25g
95% 乙醇 10. 0mL
蒸餾水
90. 0mL
GB4789. 36 — 2016
11
A. 8. 3. 2  制法
將沙黃溶解于乙醇中,然后用蒸餾水稀釋。
A. 8. 4  染色法
A. 8. 4. 1  涂片在火焰上固定,滴加結(jié)晶紫染液,染 1min ,水洗。
A. 8. 4. 2  滴加革蘭氏碘液,作用 1min ,水洗。
A. 8. 4. 3  滴加 95% 乙醇脫色約 15s~30s ,直至染色液被洗掉,不要過(guò)分脫色,水洗。
A. 8. 4. 4  滴加復(fù)染液,復(fù)染 1min ,水洗、待干、鏡檢。
A. 9 PBS-Tween20 洗液
按照商品用 E . coli O157 免疫磁珠的洗液配方進(jìn)行制備,或按照下列配方制備。
A. 9. 1  成分
氯化鈉
8. 0g
氯化鉀
0. 2g
磷酸氫二鈉( Na
2 HPO 4 1. 15g
磷酸二氫鉀( KH 2 PO 4 )
0. 2g
Tween20 0. 5g
蒸餾水
1000mL
A. 9. 2  制法
將上述成分溶解于水中,于 20 ℃~25 ℃ 下校正
pH
至 7.
3±0. 2 ,分裝錐形瓶。 121 ℃ 高壓滅菌
15min ,備用。