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中 華 人 民 共 和 國(guó) 國(guó) 家 標(biāo) 準(zhǔn)
GB4789. 40 — 2016
食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)
食品微生物學(xué)檢驗(yàn)
克羅諾桿菌屬(阪崎腸桿菌)檢驗(yàn)
2016-12-23 發(fā)布 2017-06-23 實(shí)施
中華人民共和國(guó)國(guó)家衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì)
國(guó) 家 食 品 藥 品 監(jiān) 督 管 理 總 局
發(fā) 布
GB4789. 40 — 2016
Ⅰ
前 言
本標(biāo)準(zhǔn)代替 GB4789. 40 — 2010 《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 阪崎腸桿菌檢驗(yàn)》、
SN / T1632. 1 — 2013 《出口奶粉中阪崎腸桿菌(克羅諾桿菌屬)檢驗(yàn)方法 第 1 部分:分離與計(jì)數(shù)》。
本標(biāo)準(zhǔn)與 GB4789.
40 — 2010 相比,主要變化如下:
———標(biāo)準(zhǔn)名稱 修改為 “食 品安全國(guó) 家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物 學(xué)檢驗(yàn) 克羅諾桿菌 屬 (阪崎 腸桿
菌)檢驗(yàn)”;
———修改了可疑菌落的挑取數(shù)量。
GB4789. 40 — 2016
1
食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)
食品微生物學(xué)檢驗(yàn)
克羅諾桿菌屬(阪崎腸桿菌)檢驗(yàn)
1  范圍
本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了食品中克羅諾桿菌屬(
Cronobacter )的檢驗(yàn)方法。
本標(biāo)準(zhǔn)適用于嬰幼兒配方食品、乳和乳制品及其原料中克羅諾桿菌屬的檢驗(yàn)。
2  設(shè)備和材料
除微生物實(shí)驗(yàn)室常規(guī)滅菌及培養(yǎng)設(shè)備外,其他設(shè)備和材料如下:
2. 1  恒溫培養(yǎng)箱: 25℃±1℃ , 36℃±1℃ , 44℃±0. 5℃ 。
2. 2  冰箱: 2℃~5℃ 。
2. 3  恒溫水浴箱: 44℃±0. 5℃ 。
2. 4  天平:感量 0. 1g 。
2. 5  均質(zhì)器。
2. 6  振蕩器。
2. 7  無(wú)菌吸管: 1mL (具 0. 01mL 刻度)、 10mL (具 0. 1mL 刻度)或微量移液器及吸頭。
2. 8  無(wú)菌錐形瓶:容量 100mL 、 200mL 、 2000mL 。
2. 9  無(wú)菌培養(yǎng)皿:直徑 90mm 。
2. 10 pH 計(jì)或
pH
比色管或精密
pH 試紙。
2. 11  全自動(dòng)微生物生化鑒定系統(tǒng)。
3  培養(yǎng)基和試劑
3. 1  緩沖蛋白胨水( bufferpeptonewater , BPW ):見(jiàn) A. 1 。
3. 2  改良月桂基硫酸鹽胰蛋白胨肉湯 - 萬(wàn)古霉素( modifiedlaurylsulfatetryptosebroth-vancomycin
medium , mLST-Vm ):見(jiàn) A. 2 。
3. 3  阪崎腸桿菌顯色培養(yǎng)基。
3. 4  胰蛋白胨大豆瓊脂( trypticasesoyagar , TSA ):見(jiàn) A. 3 。
3. 5  生化鑒定試劑盒。
3. 6  氧化酶試劑:見(jiàn) A. 4 。
3. 7 L- 賴氨酸脫羧酶培養(yǎng)基:見(jiàn) A. 5 。
3. 8 L- 鳥(niǎo)氨酸脫羧酶培養(yǎng)基:見(jiàn) A. 6 。
3. 9 L- 精氨酸雙水解酶培養(yǎng)基:見(jiàn) A. 7 。
3. 10  糖類發(fā)酵培養(yǎng)基:見(jiàn) A. 8 。
3. 11  西蒙氏檸檬酸鹽培養(yǎng)基:見(jiàn) A. 9 。
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第一法 克羅諾桿菌屬定性檢驗(yàn)
4  檢驗(yàn)程序
克羅諾桿菌屬檢驗(yàn)程序見(jiàn)圖 1 。
圖 1  克羅諾桿菌屬檢驗(yàn)程序
5  操作步驟
5. 1  前增菌和增菌
取檢樣 100g ( mL )置滅菌錐形瓶中,加入 900mL 已預(yù)熱至 44℃ 的緩沖蛋白胨水,用手緩緩地?fù)u
動(dòng)至充分溶解,
36℃±1℃ 培養(yǎng) 18h±2h 。移取 1mL 轉(zhuǎn)種于 10mLmLST-Vm 肉湯, 44℃±0. 5℃
培養(yǎng) 24h±2h 。
5. 2  分離
5. 2. 1  輕輕混勻 mLST-Vm 肉湯培養(yǎng)物,各取增菌培養(yǎng)物 1 環(huán),分別劃線接種于兩個(gè)阪崎腸桿菌顯色
培養(yǎng)基平板,顯色培養(yǎng)基須符合 GB4789.
28 的要求, 36℃±1℃ 培養(yǎng) 24h±2h ,或按培養(yǎng)基要求條件
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培養(yǎng)。
5. 2. 2  挑取至少 5 個(gè)可疑菌落,不足 5 個(gè)時(shí)挑取全部可疑菌落,劃線接種于 TSA 平板。 25℃±1℃ 培
養(yǎng) 48h±4h 。
5. 3  鑒定
自 TSA 平板上直接挑取黃色可疑菌落,進(jìn)行生化鑒定。克羅諾桿菌屬的主要生化特征見(jiàn)表 1 �？�
選擇生化鑒定試劑盒或全自動(dòng)微生物生化鑒定系統(tǒng)。
表 1  克羅諾桿菌屬的主要生化特征
生化試驗(yàn) 特 征
黃色素產(chǎn)生
+
氧化酶
-
L- 賴氨酸脫羧酶 -
L- 鳥(niǎo)氨酸脫羧酶
( + )
L- 精氨酸雙水解酶 +
檸檬酸水解 ( + )
發(fā)酵
D- 山梨醇
L- 鼠李糖
D- 蔗糖
D- 蜜二糖
苦杏仁甙
( - )
+
+
+
+
注: +>99% 陽(yáng)性; ->99% 陰性;( + ) 90%~99% 陽(yáng)性;( - ) 90%~99% 陰性。
6  結(jié)果與報(bào)告
綜合菌落形態(tài)和生化特征,報(bào)告每 100g ( mL )樣品中檢出或未檢出克羅諾桿菌屬。
第二法 克羅諾桿菌屬的計(jì)數(shù)
7  操作步驟
7. 1  樣品的稀釋
7. 1. 1  固體和半固體樣品:無(wú)菌稱取樣品 100g 、 10g 、 1g 各三份,分別加入 900mL 、 90mL 、 9mL 已預(yù)
熱至 44℃ 的 BPW ,輕輕振搖使充分溶解,制成 1∶10 樣品勻液,置 36℃±1℃ 培養(yǎng) 18h±2h 。分別移
取 1mL 轉(zhuǎn)種于 10mLmLST-Vm 肉湯,
44℃±0. 5℃ 培養(yǎng) 24h±2h 。
7. 1. 2  液體樣品:以無(wú)菌吸管分別取樣品 100mL 、 10mL 、 1mL 各三份,分別加入 900mL 、 90mL 、
9mL 已預(yù)熱至 44℃ 的 BPW ,輕輕振搖使充分混勻,制成 1∶10 樣品勻液,置 36℃±1℃ 培養(yǎng) 18h±
2h 。分別移取 1mL 轉(zhuǎn)種于 10mLmLST-Vm 肉湯, 44℃±0. 5℃ 培養(yǎng) 24h±2h 。
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7. 2  分離、鑒定
同 5.
2 和 5. 3 。
8  結(jié)果與報(bào)告
綜合菌落形態(tài)、生化特征,根據(jù)證實(shí)為克羅諾桿菌屬的陽(yáng)性管數(shù),查 MPN 檢索表,報(bào)告每 100g
( mL )樣品中克羅諾桿菌屬的 MPN 值(見(jiàn)表 B.
1 )。
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附 錄 A
培養(yǎng)基和試劑
A. 1  緩沖蛋白胨水( BPW )
A. 1. 1  成分
蛋白胨
10. 0g
氯化鈉
5. 0g
磷酸氫二鈉( Na
2 HPO 4 · 12H 2 O ) 9. 0g
磷酸二氫鉀
1. 5g
蒸餾水
1000mL
A. 1. 2  制法
加熱攪拌至溶解,調(diào)節(jié)
pH
至 7.
2±0. 2 , 121℃ 高壓滅菌 15min 。
A. 2  改良月桂基硫酸鹽胰蛋白胨肉湯 - 萬(wàn)古霉素( Modifiedlaurylsulfatetryptosebroth-vancomycinmedium , mLST-Vm )
A. 2. 1  改良月桂基硫酸鹽胰蛋白胨( mLST )肉湯
A. 2. 1. 1  成分
氯化鈉
34. 0g
胰蛋白胨
20. 0g
乳糖
5. 0g
磷酸二氫鉀
2. 75g
磷酸氫二鉀
2. 75g
十二烷基硫酸鈉
0. 1g
蒸餾水
1000mL
A. 2. 1. 2  制法
加熱攪拌至溶解,調(diào)節(jié)
pH
至 6.
8±0. 2 。分裝每管 10mL , 121℃ 高壓滅菌 15min 。
A. 2. 2  萬(wàn)古霉素溶液
A. 2. 2. 1  成分
萬(wàn)古霉素
10. 0mg
蒸餾水
10. 0mL
A. 2. 2. 2  制法
10. 0mg 萬(wàn)古霉素溶解于 10. 0mL 蒸餾水,過(guò)濾除菌。萬(wàn)古霉素溶液可以在 0℃~5℃ 保存 15d 。
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A. 2. 3  改良月桂基硫酸鹽胰蛋白胨肉湯 - 萬(wàn)古霉素( Modifiedlaurylsulfatetryptosebroth-vancomycin
medium , mLST-Vm )
每 10mLmLST 加入萬(wàn)古霉素溶液 0. 1mL ,混合液中萬(wàn)古霉素的終濃度為 10 μ g / mL 。
注: mLST-Vm 必須在 24h 之內(nèi)使用。
A. 3  胰蛋白胨大豆瓊脂( TSA )
A. 3. 1  成分
胰蛋白胨
15. 0g
植物蛋白胨
5. 0g
氯化鈉
5. 0g
瓊脂
15. 0g
蒸餾水
1000mL
A. 3. 2  制法
加熱攪拌至溶解,煮沸 1min ,調(diào)節(jié)
pH
至 7.
3±0. 2 , 121℃ 高壓 15min 。
A. 4  氧化酶試劑
A. 4. 1  成分
N , N , N' , N' - 四甲基對(duì)苯二胺鹽酸鹽 1. 0g
蒸餾水
100mL
A. 4. 2  制法
少量新鮮配制,于冰箱內(nèi)避光保存,在 7d 之內(nèi)使用。
A. 4. 3  試驗(yàn)方法
用玻璃棒或一次性接種針挑取單個(gè)特征性菌落,涂布在氧化酶試劑濕潤(rùn)的濾紙平板上。如果濾紙
在 10s 中之內(nèi)未變?yōu)樽霞t色、紫色或深藍(lán)色,則為氧化酶試驗(yàn)陰性,否則即為氧化酶實(shí)驗(yàn)陽(yáng)性。
注:實(shí)驗(yàn)中切勿使用鎳/鉻材料。
A. 5 L- 賴氨酸脫羧酶培養(yǎng)基
A. 5. 1  成分
L- 賴氨酸鹽酸鹽( L-lysinemonohydrochloride ) 5. 0g
酵母浸膏
3. 0g
葡萄糖
1. 0g
溴甲酚紫
0. 015g
蒸餾水
1000mL
A. 5. 2  制法
將各成分加熱溶解,必要時(shí)調(diào)節(jié)
pH
至 6.
8±0. 2 。每管分裝 5mL , 121℃ 高壓 15min 。
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A. 5. 3  實(shí)驗(yàn)方法
挑取培養(yǎng)物接種于 L- 賴氨酸脫羧酶培養(yǎng)基,剛好在液體培養(yǎng)基的液面下。 30℃±1℃ 培養(yǎng) 24h±
2h ,觀察結(jié)果。 L- 賴氨酸脫羧酶試驗(yàn)陽(yáng)性者,培養(yǎng)基呈紫色,陰性者為黃色,空白對(duì)照管為紫色。
A. 6 L- 鳥(niǎo)氨酸脫羧酶培養(yǎng)基
A. 6. 1  成分
L- 鳥(niǎo)氨酸鹽酸鹽( L-ornithinemonohydrochloride ) 5. 0g
酵母浸膏
3. 0g
葡萄糖
1. 0g
溴甲酚紫
0. 015g
蒸餾水
1000mL
A. 6. 2  制法
將各成分加熱溶解,必要時(shí)調(diào)節(jié)
pH
至 6.
8±0. 2 。每管分裝 5mL 。 121℃ 高壓 15min 。
A. 6. 3  實(shí)驗(yàn)方法
挑取培養(yǎng)物接種于 L- 鳥(niǎo)氨酸脫羧酶培養(yǎng)基,剛好在液體培養(yǎng)基的液面下。 30℃±1℃ 培養(yǎng) 24h±
2h ,觀察結(jié)果。 L- 鳥(niǎo)氨酸脫羧酶試驗(yàn)陽(yáng)性者,培養(yǎng)基呈紫色,陰性者為黃色。
A. 7 L- 精氨酸雙水解酶培養(yǎng)基
A. 7. 1  成分
L- 精氨酸鹽酸鹽( L-argininemonohydrochloride ) 5. 0g
酵母浸膏
3. 0g
葡萄糖
1. 0g
溴甲酚紫
0. 015g
蒸餾水
1000mL
A. 7. 2  制法
將各成分加熱溶解,必要時(shí)調(diào)節(jié)
pH
至 6.
8±0. 2 。每管分裝 5mL 。 121℃ 高壓 15min 。
A. 7. 3  實(shí)驗(yàn)方法
挑取培養(yǎng)物接種于 L- 精氨酸脫羧酶培養(yǎng)基,剛好在液體培養(yǎng)基的液面下。 30℃±1℃ 培養(yǎng) 24h±
2h ,觀察結(jié)果。 L- 精氨酸脫羧酶試驗(yàn)陽(yáng)性者,培養(yǎng)基呈紫色,陰性者為黃色。
A. 8  糖類發(fā)酵培養(yǎng)基
A. 8. 1  基礎(chǔ)培養(yǎng)基
A. 8. 1. 1  成分
酪蛋白(酶消化)
10. 0g
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8
氯化鈉
5. 0g
酚紅
0. 02g
蒸餾水
1000mL
A. 8. 1. 2  制法
將各成分加熱溶解,必要時(shí)調(diào)節(jié)
pH
至 6.
8±0. 2 。每管分裝 5mL 。 121℃ 高壓 15min 。
A. 8. 2  糖類溶液( D- 山梨醇、 L- 鼠李糖、 D- 蔗糖、 D- 蜜二糖、苦杏仁甙)
A. 8. 2. 1  成分
糖
8. 0g
蒸餾水
100mL
A. 8. 2. 2  制法
分別稱取 D- 山梨醇、 L- 鼠李糖、 D- 蔗糖、 D- 蜜二糖、苦杏仁甙等糖類成分各
8g ,溶于
100mL 蒸餾水
中,過(guò)濾除菌,制成 80mg / mL 的糖類溶液。
A. 8. 3  完全培養(yǎng)基
A. 8. 3. 1  成分
基礎(chǔ)培養(yǎng)基
875mL
糖類溶液
125mL
A. 8. 3. 2  制法
無(wú)菌操作,將每種糖類溶液加入基礎(chǔ)培養(yǎng)基,混勻;分裝到無(wú)菌試管中,每管 10mL 。
A. 8. 4  實(shí)驗(yàn)方法
挑取培養(yǎng)物接種于各種糖類發(fā)酵培養(yǎng)基,剛好在液體培養(yǎng)基的液面下。 30 ℃±1 ℃ 培養(yǎng) 24h±
2h ,觀察結(jié)果。糖類發(fā)酵試驗(yàn)陽(yáng)性者,培養(yǎng)基呈黃色,陰性者為紅色。
A. 9  西蒙氏檸檬酸鹽培養(yǎng)基
A. 9. 1  成分
檸檬酸鈉
2. 0g
氯化鈉
5. 0g
磷酸氫二鉀
1. 0g
磷酸二氫銨
1. 0g
硫酸鎂
0. 2g
溴麝香草酚藍(lán)
0. 08g
瓊脂
8. 0g~18. 0g
蒸餾水
1000mL
A. 9. 2  制法
將各成分加熱溶解,必要時(shí)調(diào)節(jié)
pH
至 6.
8±0. 2 。每管分裝 10mL , 121℃ 高壓 15min ,制成斜面。
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A. 9. 3  實(shí)驗(yàn)方法
挑取培養(yǎng)物接種于整個(gè)培養(yǎng)基斜面,
36 ℃±1 ℃ 培養(yǎng) 24h±2h ,觀察結(jié)果。陽(yáng)性者培養(yǎng)基變?yōu)?br /> 藍(lán)色。
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10
附 錄 B
克羅諾桿菌屬最可能數(shù)( MPN )檢索表
每 100g ( mL )檢樣中克羅諾桿菌屬最可能數(shù)( MPN )的檢索見(jiàn)表 B.
1 。
表 B.
1  克羅諾桿菌屬最可能數(shù)( MPN )檢索表
陽(yáng)性管數(shù)
100 10 1
MPN
95% 可信限
下限 上限
陽(yáng)性管數(shù)
100 10 1
MPN
95% 可信限
下限 上限
0 0 0 <0. 3
—
0. 95 2 2 0 2. 1 0. 45 4. 2
0 0 1 0. 3 0. 015 0. 96 2 2 1 2. 8 0. 87 9. 4
0 1 0 0. 3 0. 015 1. 1 2 2 2 3. 5 0. 87 9. 4
0 1 1 0. 61 0. 12 1. 8 2 3 0 2. 9 0. 87 9. 4
0 2 0 0. 62 0. 12 1. 8 2 3 1 3. 6 0. 87 9. 4
0 3 0 0. 94 0. 36 3. 8 3 0 0 2. 3 0. 46 9. 4
1 0 0 0. 36 0. 017 1. 8 3 0 1 3. 8 0. 87 11
1 0 1 0. 72 0. 13 1. 8 3 0 2 6. 4 1. 7 18
1 0 2 1. 1 0. 36 3. 8 3 1 0 4. 3 0. 9 18
1 1 0 0. 74 0. 13 2 3 1 1 7. 5 1. 7 20
1 1 1 1. 1 0. 36 3. 8 3 1 2 12 3. 7 42
1 2 0 1. 1 0. 36 4. 2 3 1 3 16 4 42
1 2 1 1. 5 0. 45 4. 2 3 2 0 9. 3 1. 8 42
1 3 0 1. 6 0. 45 4. 2 3 2 1 15 3. 7 42
2 0 0 0. 92 0. 14 3. 8 3 2 2 21 4 43
2 0 1 1. 4 0. 36 4. 2 3 2 3 29 9 100
2 0 2 2 0. 45 4. 2 3 3 0 24 4. 2 100
2 1 0 1. 5 0. 37 4. 2 3 3 1 46 9 200
2 1 1 2 0. 45 4. 2 3 3 2 110 18 410
2 1 2 2. 7 0. 87 9. 4 3 3 3 >110 42
—
注 1 :本表采用 3 個(gè)檢樣量[ 100g ( mL )、 10g ( mL )和 1g ( mL )],每個(gè)檢樣量接種 3 管。
注 2 :表內(nèi)所列檢樣量如改用 1000g ( mL )、 100g ( mL )和 10g ( mL )時(shí),表內(nèi)數(shù)字應(yīng)相應(yīng)降低 10 倍;如改用 10g
( mL )、
1g ( mL )和 0.
1g ( mL )時(shí),則表內(nèi)數(shù)字應(yīng)相應(yīng)增高 10
倍,其余類推。