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中 華 人 民 共 和 國 國 家 標(biāo) 準(zhǔn)
GB4789. 6 — 2016
食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)
食品微生物學(xué)檢驗
致瀉大腸埃希氏菌檢驗
2016-12-23 發(fā)布 2017-06-23 實施
中華人民共和國國家衛(wèi)生和計劃生育委員會
國 家 食 品 藥 品 監(jiān) 督 管 理 總 局
發(fā) 布
GB4789. 6 — 2016
Ⅰ
前 言
本標(biāo)準(zhǔn)代替 GB / T4789. 6 — 2003 《食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗 致瀉大腸埃希氏菌檢驗》。
本標(biāo)準(zhǔn)與 GB / T4789.
6 — 2003 相比,主要變化如下:
———標(biāo)準(zhǔn)名稱修改為“食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗 致瀉大腸埃希氏菌檢驗”;
———增加了術(shù)語和定義、縮略語;
———增加了血清學(xué)試驗中 H 抗原鑒定;
———增加了 PCR 確認(rèn)試驗;
———增加了附錄 A ;
———修改了設(shè)備和材料;
———修改了培養(yǎng)基和試劑;
———修改了檢驗程序;
———修改了血清學(xué)試驗中致瀉大腸埃希氏菌所包括的 O 抗原群;
———刪除了腸毒素試驗。
GB4789. 6 — 2016
1
食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)
食品微生物學(xué)檢驗
致瀉大腸埃希氏菌檢驗
1  范圍
本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了食品中致瀉大腸埃希氏菌(
diarrheagenic Escherichiacoli )的檢驗方法。
本標(biāo)準(zhǔn)適用于食品中致瀉大腸埃希氏菌的檢驗。
2  術(shù)語和定義、縮略語
2. 1  術(shù)語和定義
下列術(shù)語和定義適用于本文件。
2. 1. 1  致瀉大腸埃希氏菌 Diarrheagenic Escherichiacoli
一類能引起人體以腹瀉癥狀為主的大腸埃希氏菌,可經(jīng)過污染食物引起人類發(fā)病。常見的致瀉大
腸埃希氏菌主要包括腸道致病性大腸埃希氏菌、腸道侵襲性大腸埃希氏菌、產(chǎn)腸毒素大腸埃希氏菌、產(chǎn)
志賀毒素大腸埃希氏菌(包括腸道出血性大腸埃希氏菌)和腸道集聚性大腸埃希氏菌。
2. 1. 2  腸道致病性大腸埃希氏菌 Enteropathogenic Escherichiacoli
能夠引起宿主腸黏膜上皮細(xì)胞黏附及擦拭性損傷,且不產(chǎn)生志賀毒素的大腸埃希氏菌。該菌是嬰
幼兒腹瀉的主要病原菌,有高度傳染性,嚴(yán)重者可致死。
2. 1. 3  腸道侵襲性大腸埃希氏菌 Enteroinvasive Escherichiacoli
能夠侵入腸道上皮細(xì)胞而引起痢疾樣腹瀉的大腸埃希氏菌。該菌無動力、不發(fā)生賴氨酸脫羧反應(yīng)、
不發(fā)酵乳糖,生化反應(yīng)和抗原結(jié)構(gòu)均近似痢疾志賀氏菌。侵入上皮細(xì)胞的關(guān)鍵基因是侵襲性質(zhì)粒上的
抗原編碼基因及其調(diào)控基因,如 ipaH 基因、
ipaR 基因(又稱為 invE 基因)。
2. 1. 4  產(chǎn)腸毒素大腸埃希氏菌 Enterotoxigenic Escherichiacoli
能夠分泌熱穩(wěn)定性腸毒素或/和熱不穩(wěn)定性腸毒素的大腸埃希氏菌。該菌可引起嬰幼兒和旅游者
腹瀉,一般呈輕度水樣腹瀉,也可呈嚴(yán)重的霍亂樣癥狀,低熱或不發(fā)熱。腹瀉常為自限性,一般 2d~3d
即自愈。
2. 1. 5  產(chǎn)志賀毒素大腸埃希氏菌 Shigatoxin-producing Escherichiacoli (腸道出血性大腸埃希氏菌
Enterohemorrhagic Escherichiacoli )
能夠分泌志賀毒素、引起宿主腸黏膜上皮細(xì)胞黏附及擦拭性損傷的大腸埃希氏菌。有些產(chǎn)志賀毒
素大腸埃希氏菌在臨床上引起人類出血性結(jié)腸炎( HC )或血性腹瀉,并可進(jìn)一步發(fā)展為溶血性尿毒綜
合征( HUS ),這類產(chǎn)志賀毒素大腸埃希氏菌為腸道出血性大腸埃希氏菌。
GB4789. 6 — 2016
2
2. 1. 6  腸道集聚性大腸埃希氏菌 Enteroaggregative Escherichiacoli
腸道集聚性大腸埃希氏菌不侵入腸道上皮細(xì)胞,但能引起腸道液體蓄積。不產(chǎn)生熱穩(wěn)定性腸毒素
或熱不穩(wěn)定性腸毒素,也不產(chǎn)生志賀毒素。唯一特征是能對 Hep-2 細(xì)胞形成集聚性黏附,也稱 Hep-2
細(xì)胞黏附性大腸埃希氏菌。
2. 2  縮略語
下列縮略語適用于本文件。
2. 2. 1 DEC :致瀉大腸埃希氏菌 Diarrheagenic Escherichiacoli
2. 2. 2 EPEC :腸道致病性大腸埃希氏菌 Enteropathogenic Escherichiacoli
2. 2. 3 EIEC :腸道侵襲性大腸埃希氏菌 Enteroinvasive Escherichiacoli
2. 2. 4 ETEC :產(chǎn)腸毒素大腸埃希氏菌 Enterotoxigenic Escherichiacoli
2. 2. 5 STEC :產(chǎn)志賀毒素大腸埃希氏菌 Shigatoxin-producing Escherichiacoli
2. 2. 6 EHEC :腸道出血性大腸埃希氏菌 Enterohemorrhagic Escherichiacoli
2. 2. 7 EAEC :腸道集聚性大腸埃希氏菌 Enteroaggregative Escherichiacoli
2. 2. 8  escV :蛋白分泌物調(diào)節(jié)基因, geneencodingLEE-encodedtypeⅢsecretionsystemfactor
2. 2. 9  eae :緊密素基因, geneencodingintiminfor Escherichiacoli attachingandeffacing
2. 2. 10  bfpB :束狀菌毛 B 基因, bundle-formingpilusB ;
2. 2. 11  stx 1 :志賀毒素 Ⅰ 基因, Shigatoxinone
2. 2. 12  stx 2 :志賀毒素 Ⅱ 基因, Shigatoxintwo
2. 2. 13  lt :熱不穩(wěn)定性腸毒素基因, heat-labileenterotoxin
2. 2. 14  st :熱穩(wěn)定性腸毒素基因, heat-stableenterotoxin
2. 2.15
stp
(
stIa ):豬源熱穩(wěn)定性腸毒素基因, heat-stableenterotoxinsinitiallydiscoveredinthe
isolatesfrompigs
2. 2. 16  sth ( stIb ):人 源 熱 穩(wěn) 定 性 腸 毒 素 基 因, heat-stableenterotoxinsinitiallydiscoveredinthe
isolatesfromhuman
2. 2. 17  invE :侵襲性質(zhì)粒調(diào)節(jié)基因, invasiveplasmidregulator
2. 2. 18  ipaH :侵襲性質(zhì)�？乖� H 基因, invasiveplasmidantigenH-gene
2. 2. 19  aggR :集聚黏附菌毛調(diào)節(jié)基因, aggregativeadhesivefimbriaeregulator
2. 2. 20  uidA :
β
- 葡萄糖苷酶基因,
β
-glucuronidasegene
2. 2. 21  astA :集聚熱穩(wěn)定性毒素 A 基因, enteroaggregativeheat-stableenterotoxinA
2. 2. 22
pic
:腸定植因子基因,
proteininvolvedinintestinalcolonization
2. 2. 23  LEE :腸細(xì)胞損傷基因座, Locusofenterocyteeffacement
2. 2. 24  EAF : EPEC 黏附因子, EPECadhesivefactor
3  設(shè)備和材料
除微生物實驗室常規(guī)滅菌及培養(yǎng)設(shè)備外,其他設(shè)備和材料如下:
3. 1  恒溫培養(yǎng)箱: 36℃±1℃ , 42℃±1℃ 。
3. 2  冰箱: 2℃~5℃ 。
3. 3  恒溫水浴箱: 50℃±1℃ , 100℃ 或適配 1. 5mL 或 2. 0mL 金屬浴( 95℃~100℃ )。
3. 4  電子天平:感量為 0. 1g 和 0. 01g 。
3. 5  顯微鏡: 10×~100× 。
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3
3. 6  均質(zhì)器。
3. 7  振蕩器。
3. 8  無菌吸管: 1mL (具 0. 01mL 刻度), 10mL (具 0. 1mL 刻度)或微量移液器及吸頭。
3. 9  無菌均質(zhì)杯或無菌均質(zhì)袋:容量 500mL 。
3. 10  無菌培養(yǎng)皿:直徑 90mm 。
3. 11 pH 計或精密
pH 試紙。
3. 12  微量離心管: 1. 5mL 或 2. 0mL 。
3. 13  接種環(huán): 1 μ L 。
3. 14  低溫高速離心機:轉(zhuǎn)速 ≥13000r / min ,控溫 4℃~8℃ 。
3. 15  微生物鑒定系統(tǒng)。
3. 16 PCR 儀。
3. 17  微量移液器及吸頭: 0. 5 μ L~2 μ L , 2 μ L~20 μ L , 20 μ L~200 μ L , 200 μ L~1000 μ L 。
3. 18  水平電泳儀:包括電源、電泳槽、制膠槽(長度 >10cm )和梳子。
3. 19 8 聯(lián)排管和 8 聯(lián)排蓋(平蓋/凸蓋)。
3. 20  凝膠成像儀。
4  培養(yǎng)基和試劑
4. 1  營養(yǎng)肉湯:見 A. 1 。
4. 2  腸道菌增菌肉湯:見 A. 2 。
4. 3  麥康凱瓊脂( MAC ):見 A. 3 。
4. 4  伊紅美藍(lán)瓊脂( EMB ):見 A. 4 。
4. 5  三糖鐵( TSI )瓊脂:見 A. 5 。
4. 6  蛋白胨水、靛基質(zhì)試劑:見 A. 6 。
4. 7  半固體瓊脂:見 A. 7 。
4. 8  尿素瓊脂( pH7. 2 ):見 A. 8 。
4. 9  氰化鉀( KCN )培養(yǎng)基:見 A. 9 。
4. 10  氧化酶試劑:見 A. 10 。
4. 11  革蘭氏染色液:見 A. 11 。
4. 12 BHI 肉湯:見 A. 12 。
4. 13  福爾馬林(含 38%~40% 甲醛)。
4. 14  鑒定試劑盒。
4. 15  大腸埃希氏菌診斷血清。
4. 16  滅菌去離子水。
4. 17 0. 85% 滅菌生理鹽水。
4. 18 TE ( pH8. 0 ):見 A. 13 。
4. 19 10×PCR 反應(yīng)緩沖液:見 A. 14 。
4. 20 25mmol
/ L MgCl
2 。
4. 21 dNTPs : dATP 、 dTTP 、 dGTP 、 dCTP 每種濃度為 2. 5mmol
/ L 。
4. 22 5U / LTaq 酶。
4. 23  引物。
4. 24 50×TAE 電泳緩沖液:見 A. 15 。
4. 25  瓊脂糖。
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4
4. 26  溴化乙錠( EB )或其他核酸染料。
4. 27 6× 上樣緩沖液:見 A. 16 。
4. 28 Marker :分子量包含 100bp 、 200bp 、 300bp 、 400bp 、 500bp 、 600bp 、 700bp 、 800bp 、 900bp 、
1000bp 、 1500bp 條帶。
4. 29  致瀉大腸埃希氏菌 PCR 試劑盒。
5  檢驗程序
致瀉大腸埃希氏菌檢驗程序見圖 1 。
圖 1  致瀉大腸埃希氏菌檢驗程序
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6  操作步驟
6. 1  樣品制備
6. 1. 1  固態(tài)或半固態(tài)樣品
固體或半固態(tài)樣品,以無菌操作稱取檢樣 25g ,加入裝有 225mL 營養(yǎng)肉湯的均質(zhì)杯中,用旋轉(zhuǎn)刀
片式均質(zhì)器以 8000r / min~10000r / min 均質(zhì) 1min~2min ;或加入裝有 225mL 營養(yǎng)肉湯的均質(zhì)袋
中,用拍擊式均質(zhì)器均質(zhì) 1min~2min 。
6. 1. 2  液態(tài)樣品
以無菌操作量取檢樣 25mL ,加入裝有 225mL 營養(yǎng)肉湯的無菌錐形瓶(瓶內(nèi)可預(yù)置適當(dāng)數(shù)量的無
菌玻璃珠),振蕩混勻。
6. 2  增菌
將 6.
1 制備的樣品勻液于 36℃±1℃ 培養(yǎng) 6h 。取 10 μ L ,接種于 30mL 腸道菌增菌肉湯管內(nèi),于
42℃±1℃ 培養(yǎng) 18h 。
6. 3  分離
將增菌液劃線接種 MAC 和 EMB 瓊脂平板,于 36 ℃±1 ℃ 培養(yǎng) 18h~24h ,觀察菌落特征。在
MAC 瓊脂平板上,分解乳糖的典型菌落為磚紅色至桃紅色,不分解乳糖的菌落為無色或淡粉色;在
EMB 瓊脂平板上,分解乳糖的典型菌落為中心紫黑色帶或不帶金屬光澤,不分解乳糖的菌落為無色或
淡粉色。
6. 4  生化試驗
6. 4. 1  選取平板上可疑菌落 10 個 ~20 個( 10 個以下全選),應(yīng)挑取乳糖發(fā)酵,以及乳糖不發(fā)酵和遲緩
發(fā)酵的菌落,分別接種 TSI 斜面。同時將這些培養(yǎng)物分別接種蛋白胨水、尿素瓊脂(
pH7. 2
)和 KCN 肉
湯。于 36℃±1℃ 培養(yǎng) 18h~24h 。
6. 4. 2 TSI 斜面產(chǎn)酸或不產(chǎn)酸,底層產(chǎn)酸,靛基質(zhì)陽性, H 2 S 陰性和尿素酶陰性的培養(yǎng)物為大腸埃希氏
菌。 TSI 斜面底層不產(chǎn)酸,或
H 2 S 、 KCN 、尿素有任一項為陽性的培養(yǎng)物,均非大腸埃希氏菌。必要時
做革蘭氏染色和氧化酶試驗。大腸埃希氏菌為革蘭氏陰性桿菌,氧化酶陰性。
6. 4. 3  如選擇生化鑒定試劑盒或微生物鑒定系統(tǒng),可從營養(yǎng)瓊脂平板上挑取經(jīng)純化的可疑菌落用無菌
稀釋液制備成濁度適當(dāng)?shù)木鷳乙?使用生化鑒定試劑盒或微生物鑒定系統(tǒng)進(jìn)行鑒定。
6. 5 PCR 確認(rèn)試驗
6. 5. 1  取生化反應(yīng)符合大腸埃希氏菌特征的菌落進(jìn)行 PCR 確認(rèn)試驗。
注: PCR 實驗室區(qū)域設(shè)計、工作基本原則及注意事項應(yīng)參照《疾病預(yù)防控制中心建設(shè)標(biāo)準(zhǔn)》(建標(biāo) 127
— 2009 )和國家
衛(wèi)生和計劃生育委員會(原衛(wèi)生部)(
2010 )《醫(yī)療機構(gòu)臨床基因擴增管理辦法》附錄(醫(yī)療機構(gòu)臨床基因擴增檢
驗實驗室工作導(dǎo)則)。
6. 5. 2  使用 1 μ L 接種環(huán)刮取營養(yǎng)瓊脂平板或斜面上培養(yǎng) 18h~24h 的菌落,懸浮在 200 μ L0. 85% 滅
菌生理鹽水中,充分打散制成菌懸液,于 13000r / min 離心 3min ,棄掉上清液。加入 1mL 滅菌去離子
水充分混勻菌體,于 100℃ 水浴或者金屬浴維持 10min ;冰浴冷卻后,
13000r / min 離心 3min ,收集上
清液;按 1∶10 的比例用滅菌去離子水稀釋上清液,取 2 μ L 作為 PCR 檢測的模板;所有處理后的 DNA
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模板直接用于 PCR 反應(yīng)或暫存于 4 ℃ 并當(dāng)天進(jìn)行 PCR 反應(yīng);否則,應(yīng)在 -20 ℃ 以下保存?zhèn)溆? 1 周
內(nèi))。也可用細(xì)菌基因組提取試劑盒提取細(xì)菌 DNA ,操作方法按照細(xì)菌基因組提取試劑盒說明書進(jìn)行。
6. 5. 3  每次 PCR 反應(yīng)使用 EPEC 、 EIEC 、 ETEC 、 STEC / EHEC 、 EAEC 標(biāo)準(zhǔn)菌株作為陽性對照。同時,
使用大腸埃希氏菌 ATCC25922 或等效標(biāo)準(zhǔn)菌株作為陰性對照,以滅菌去離子水作為空白對照,控制
PCR 體系污染。致瀉大腸埃希氏菌特征性基因見表 1 。
表 1  五種致瀉大腸埃希氏菌特征基因
致瀉大腸埃希氏菌類別 特征性基因
EPEC escV 或 eae 、 bfpB
STEC / EHEC escV 或 eae 、 stx 1 、 stx 2
EIEC invE 或 ipaH
ETEC lt 、
stp
、
sth
EAEC astA 、 aggR 、
pic
uidA
6. 5. 4 PCR 反應(yīng)體系配制。每個樣品初篩需配置 12 個 PCR 擴增反應(yīng)體系,對應(yīng)檢測 12 個目標(biāo)基因,
具體操作如下:使用 TE 溶液(
pH8. 0 )將合成的引物干粉稀釋成 100 μ mol /
L 儲存液。根據(jù)表 2 中每種
目標(biāo)基因?qū)��?yīng) PCR 體系內(nèi)引物的終濃度,使用滅菌去離子水配制 12 種目標(biāo)基因擴增所需的 10× 引物
工作液(以 uidA 基因為例,如表 3 )。將 10× 引物工作液、 10×PCR 反應(yīng)緩沖液、 25mmol / L MgCl
2 、
2. 5mmol
/ LdNTPs 、滅菌去離子水從 -20 ℃ 冰箱中取出,融化并平衡至室溫,使用前混勻;
5U / μ L
Taq
酶在加樣前從 -20℃ 冰箱中取出。每個樣品按照表 4 的加液量配制 12 個 25 μ L 反應(yīng)體系,分別
使用 12 種目標(biāo)基因?qū)��?yīng)的 10× 引物工作液。
表 2  五種致瀉大腸埃希氏菌目標(biāo)基因引物序列及每個 PCR 體系內(nèi)的終濃度 c
引物
名稱
引物序列 c
菌株編號及對應(yīng)
Genbank 編碼
引物所在位置
終濃度 n
(
μ mol
/ L )
PCR 產(chǎn)物
長度(
bp
)
uidA -F
5 ’ -ATG CCA GTC CAG CGT
TTTTGC-3 ’
Escherichiacoli
DH1Ec169 ( accessionno.
CP012127. 1 )
1673870-1673890 0. 2
1487
uidA -R
5 ’ -AAA GTG TGG GTC AAT
AATCAGGAAGTG-3 ’
1675356-1675330 0. 2
escV -F
5 ’ -ATT CTG GCT CTC TTC
TTCTTTATGGCTG-3 ’
Escherichiacoli
E2348 / 69 ( accessionno.
FM180568. 1 )
4122765-4122738 0. 4
544
escV -R
5 ’ -CGT CCC CTT TTA CAA
ACTTCATCGC-3 ’
4122222-4122246 0. 4
eae -F
a
5 ’ -ATT ACC ATC CAC ACA
GACGGT-3 ’ EHEC ( accessionno.
Z11541. 1 )
2651-2671 0. 2
397
eae -R
a
5 ’ -ACA GCG TGG TTG GAT
CAACCT-3 ’
3047-3027 0. 2
bfpB -F
5 ’ -GAC ACC TCA TTG CTG
AAGTCG-3 ’
Escherichiacoli
E2348 / 69 ( accession
no.FM180569. 1 )
3796-3816 0. 1 910
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表 2 (續(xù))
引物
名稱
引物序列 c
菌株編號及對應(yīng)
Genbank 編碼
引物所在位置
終濃度 n
(
μ mol
/ L )
PCR 產(chǎn)物
長度(
bp
)
bfpB -R
5 ’ -CCA GAA CAC CTC CGT
TATGC-3 ’
4702-4683 0. 1
stx 1-F
5 ’ -CGA TGT TAC GGT TTG
TTACTGTGACAGC-3 ’
stx 1-R
5 ’ -AAT GCC ACG CTT CCC
AGAATTG-3 ’
Escherichiacoli
EDL933 ( accessionno.
AE005174. 2 )
2996445-2996418 0. 2
2996202-2996223 0. 2
244
stx 2-F
5 ’ -GTT TTG ACC ATC TTC
GTCTGATTATTGAG-3 ’
stx 2-R
5 ’ -AGC GTA AGG CTT CTG
CTGTGAC-3 ’
Escherichiacoli
EDL933 ( accessionno.
AE005174. 2 )
1352543-1352571 0. 4
1352866-1352845 0. 4
324
lt -F
5 ’ -GAA CAG GAG GTT TCT
GCGTTAGGTG-3 ’
lt -R
5 ’ -CTT TCA ATG GCT TTT
TTTTGGGAGTC-3 ’
Escherichiacoli
E24377A ( accessionno.
CP000795. 1 )
17030-17054 0. 1
17684-17659 0. 1
655
stp
-F
5 ’ -CCT CTT TTA GYC AGA
CARCTGAATCASTTG-3 ’
stp
-R
5 ’ -CAG GCA GGA TTA CAA
CAAAGTTCACAG-3 ’
EscherichiacoliEC2173
(
accessionno.
AJ555214. 1 )///
EscherichiacoliF7682
(
accessionno.
AY342057. 1 )
1979-1950 /// 14-43 0. 4
1823-1849 /// 170-144 0. 4
157
sth -F
5 ’ -TGT CTT TTT CAC CTT
TCGCTC-3 ’
sth -R
5 ’ -CGG TAC AAG CAG GAT
TACAACAC-3 ’
Escherichiacoli
E24377A ( accession
no.CP000795. 1 )
11389-11409 0. 2
11559-11537 0. 2
171
invE -F
5 ’ -CGA TAG ATG GCG AGA
AATTATATCCCG-3 ’
invE -R
5 ’ -CGA TCA AGA ATC CCT
AACAGAAGAATCAC-3 ’
Escherichiacoli
serotypeO164
(
accessionno.
AF283289. 1 )
921-895 0. 2
156-184 0. 2
766
ipaH -F
b
5 ’ -TTG ACC GCC TTT CCG
ATACC-3 ’
Escherichiacoli53638
(
accessionno.
CP001064. 1 )
11471-11490 0. 1 647
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8
表 2 (續(xù))
引物
名稱
引物序列 c
菌株編號及對應(yīng)
Genbank 編碼
引物所在位置
終濃度 n
(
μ mol
/ L )
PCR 產(chǎn)物
長度(
bp
)
ipaH -R
b
5 ’ -ATC CGC ATC ACC GCT
CAGAC-3 ’
12117-12098 0. 1
aggR -F
5 ’ -ACG CAG AGT TGC CTG
ATAAAG-3 ’
aggR -R
5 ’ -AAT ACA GAA TCG TCA
GCATCAGC-3 ’
Escherichiacoli
enteroaggregative17-2
(
accessionno.Z18751. 1 )
59-79 0. 2
458-436 0. 2
400
pic
-F
5 ’ -AGC CGT TTC CGC AGA
AGCC-3 ’
pic
-R
5 ’ -AAA TGT CAG TGA ACC
GACGATTGG-3 ’
Escherichiacoli042
(
accessionno.
AF097644. 1 )
3700-3682 0. 2
2590-2613 0. 2
1111
astA -F
5 ’ -TGC CAT CAA CAC AGT
ATATCCG-3 ’
astA -R
5 ’ -ACG GCT TTG TAG TCC
TTCCAT-3 ’
Escherichiacoli
ECOR33 ( accession
no.AF161001. 1 )
2-23 0. 4
103-83 0. 4
102
16 S
rDNA-F
5 ’ -GGA GGC AGC AGT GGG
AATA-3 ’
16 S
rDNA-R
5 ’ -TGA CGG GCG GTG TGT
ACAAG-3 ’
Escherichiacolistrain
ST2747 ( accessionno.
CP007394. 1 )
149585-149603 0. 25
150645-150626 0. 25
1062
a escV 和 eae 基因選作其中一個;
b invE 和 ipaH
基因選作其中一個;
c
表中不同基因的引物序列可采用可靠性驗證的其他序列代替。
表 3  每種目標(biāo)基因擴增所需 10× 引物工作液配制表
引物名稱 體積/
μ L
100 μ mol / L uidA -F 10× n
100 μ mol / L uidA -R 10× n
滅菌去離子水
100-2× ( 10× n )
總體積
100
注: n ———每條引物在反應(yīng)體系內(nèi)的終濃度(詳見表 2 )。
GB4789. 6 — 2016
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表 4  五種致瀉大腸埃希氏菌目標(biāo)基因擴增體系配制表
試劑名稱 加樣體積/
μ L
滅菌去離子水
12. 1
10×PCR 反應(yīng)緩沖液 2. 5
25mmol / L MgCl 2 2. 5
2. 5mmol / LdNTPs 3. 0
10× 引物工作液 2. 5
5U / μ LTaq 酶 0. 4
DNA 模板 2. 0
總體積
25
6. 5. 5 PCR 循環(huán)條件。預(yù)變性 94℃5min ;變性 94℃30s ,復(fù)性 63℃30s ,延伸 72℃1. 5min , 30 個
循環(huán);
72℃ 延伸 5min 。將配制完成的 PCR 反應(yīng)管放入 PCR 儀中,核查 PCR 反應(yīng)條件正確后,啟動反
應(yīng)程序。
6. 5. 6  稱量 4. 0g 瓊脂糖粉,加入至 200mL 的 1×TAE 電泳緩沖液中,充分混勻。使用微波爐反復(fù)加
熱至沸騰,直到瓊脂糖粉完全融化形成清亮透明的溶液。待瓊脂糖溶液冷卻至 60℃ 左右時,加入溴化
乙錠( EB )至終濃度為 0.
5 μ g / mL ,充分混勻后,輕輕倒入已放置好梳子的模具中,凝膠長度要大于
10cm ,厚度宜為 3mm~5mm 。檢查梳齒下或梳齒間有無氣泡,用一次性吸頭小心排掉瓊脂糖凝膠中
的氣泡。當(dāng)瓊脂糖凝膠完全凝結(jié)硬化后,輕輕拔出梳子,小心將膠塊和膠床放入電泳槽中,樣品孔放置
在陰極端。向電泳槽中加入 1×TAE 電泳緩沖液,液面高于膠面 1mm~2mm 。將 5 μ LPCR 產(chǎn)物與
1 μ L6× 上樣緩沖液混勻后,用微量移液器吸取混合液垂直伸入液面下膠孔,小心上樣于孔中;陽性對
照的 PCR 反應(yīng)產(chǎn)物加入到最后一個泳道;第一個泳道中加入 2 μ L 分子量 Marker 。接通電泳儀電源,
根據(jù)公式:電壓 = 電泳槽正負(fù)極間的距離(
cm ) ×5V / cm 計算并設(shè)定電泳儀電壓數(shù)值;啟動電壓開關(guān),
電泳開始以正負(fù)極鉑金絲出現(xiàn)氣泡為準(zhǔn)。電泳 30min~45min 后,切斷電源。取出凝膠放入凝膠成像
儀中觀察結(jié)果,拍照并記錄數(shù)據(jù)。
6. 5. 7  結(jié)果判定。電泳結(jié)果中空白對照應(yīng)無條帶出現(xiàn),陰性對照僅有 uidA 條帶擴增,陽性對照中出現(xiàn)
所有目標(biāo)條帶,
PCR 試驗結(jié)果成立。根據(jù)電泳圖中目標(biāo)條帶大小,判斷目標(biāo)條帶的種類,記錄每個泳道
中目標(biāo)條帶的種類,在表 5 中查找不同目標(biāo)條帶種類及組合所對應(yīng)的致瀉大腸埃希氏菌類別。
表 5  五種致瀉大腸埃希氏菌目標(biāo)條帶與型別對照表
致瀉大腸埃希氏菌類別 目標(biāo)條帶的種類組合
EAEC aggR , astA ,
pic
中一條或一條以上陽性
EPEC bfpB ( + / - ), escV a ( + ), stx 1 ( - ), stx 2 ( - )
STEC / EHEC
escV a ( + / - ), stx 1 ( + ), stx 2 ( - ), bfpB ( - )
escV a ( + / - ), stx 1 ( - ), stx 2 ( + ), bfpB ( - )
escV a ( + / - ), stx 1 ( + ), stx 2 ( + ), bfpB ( - )
ETEC lt ,
stp
,
sth 中一條或一條以上陽性
EIEC invE b ( + )
uidA c ( + / - )
a 在判定 EPEC 或 SETC / EHEC 時, escV 與 eae 基因等效;
b
在判定 EIEC 時,
invE 與 ipaH 基因等效。
c 97%
以上大腸埃希氏菌為 uidA 陽性。
GB4789. 6 — 2016
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6. 5. 8  如用商品化 PCR 試劑盒或多重聚合酶鏈反應(yīng)( MPCR )試劑盒,應(yīng)按照試劑盒說明書進(jìn)行操作和
結(jié)果判定。
6. 6  血清學(xué)試驗(選做項目)
6. 6. 1  取 PCR 試驗確認(rèn)為致瀉大腸埃希氏菌的菌株進(jìn)行血清學(xué)試驗。
注:應(yīng)按照生產(chǎn)商提供的使用說明進(jìn)行 O 抗原和 H 抗原的鑒定。當(dāng)生產(chǎn)商的使用說明與下面的描述可能有偏差
時,按生產(chǎn)商提供的使用說明進(jìn)行。
6. 6. 2 O 抗原鑒定
6. 6. 2. 1  假定試驗:挑取經(jīng)生化試驗和 PCR 試驗證實為致瀉大腸埃希氏菌的營養(yǎng)瓊脂平板上的菌落,
根據(jù)致瀉大腸埃希氏菌的類別,選用大腸埃希氏菌單價或多價 OK 血清做玻片凝集試驗。當(dāng)與某一種
多價 OK 血清凝集時,再與該多價血清所包含的單價 OK 血清做凝集試驗。致瀉大腸埃希氏菌所包括
的 O 抗原群見表 6 。如與某一單價 OK 血清呈現(xiàn)凝集反應(yīng),即為假定試驗陽性。
6. 6. 2. 2  證實試驗:用 0. 85% 滅菌生理鹽水制備 O 抗原懸液,稀釋至與 MacFarland3 號比濁管相當(dāng)?shù)?br /> 濃度。原效價為 1∶160~1∶320 的 O 血清,用 0.
5% 鹽水稀釋至 1∶40 。將稀釋血清與抗原懸液于
10mm×75mm 試管內(nèi)等量混合,做單管凝集試驗�；靹蚝蠓庞� 50℃±1℃ 水浴箱內(nèi),經(jīng) 16h 后觀察
結(jié)果。如出現(xiàn)凝集,可證實為該 O 抗原。
表 6  致瀉大腸埃希氏菌主要的 O 抗原
DEC 類別 DEC 主要的 O 抗原
EPEC O26O55O86O111abO114O119O125acO127O128abO142O158 等
STEC / EHEC O4O26O45O91O103O104O111O113O121O128O157 等
EIEC O28acO29O112acO115O124O135O136O143O144O152O164O167 等
ETEC
O6O11O15O20O25O26O27O63O78O85O114O115O128acO148O149O159
O166O167 等
EAEC O9O62O73O101O134 等
6. 6. 3 H 抗原鑒定
6. 6. 3. 1  取菌株穿刺接種半固體瓊脂管, 36℃±1 ℃ 培養(yǎng) 18h~24h ,取頂部培養(yǎng)物 1 環(huán)接種至 BHI
液體培養(yǎng)基中,于 36℃±1℃ 培養(yǎng) 18h~24h 。加入福爾馬林至終濃度為 0.
5% ,做玻片凝集或試管凝
集試驗。
6. 6. 3. 2  若待測抗原與血清均無明顯凝集,應(yīng)從首次穿刺培養(yǎng)管中挑取培養(yǎng)物,再進(jìn)行 2 次 ~3 次半固
體管穿刺培養(yǎng),按照 6.
6. 3. 1 進(jìn)行試驗。
7  結(jié)果報告
7. 1  根據(jù)生化試驗、 PCR 確認(rèn)試驗的結(jié)果,報告 25g (或 25mL )樣品中檢出或未檢出某類致瀉大腸埃
希氏菌。
7. 2  如果進(jìn)行血清學(xué)試驗,根據(jù)血清學(xué)試驗的結(jié)果,報告 25g (或 25mL )樣品中檢出的某類致瀉大腸
埃希氏菌血清型別。
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附 錄 A
培養(yǎng)基和試劑
A. 1  營養(yǎng)肉湯
A. 1. 1  成分
蛋白胨 10.
0g
牛肉膏
3. 0g
氯化鈉
5. 0g
蒸餾水
1000mL
A. 1. 2  制法
將以上成分混合加熱溶解,冷卻至 25℃ 左右校正
pH
至 7.
4±0. 2 ,分裝適當(dāng)?shù)娜萜鳌?121 ℃ 滅菌
15min 。
A. 2  腸道菌增菌肉湯
A. 2. 1  成分
蛋白胨
10. 0g
葡萄糖
5. 0g
牛膽鹽
20. 0g
磷酸氫二鈉
8. 0g
磷酸二氫鉀
2. 0g
煌綠
0. 015g
蒸餾水
1000mL
A. 2. 2  制法
將以上成分混合加熱溶解,冷卻至 25℃ 左右校正
pH
至 7.
2±0. 2 ,分裝每瓶 30mL 。 115 ℃ 滅菌
20min 。
A. 3  麥康凱瓊脂( MAC )
A. 3. 1  成分
蛋白胨
20. 0g
乳糖
10. 0g
3 號膽鹽 1. 5g
氯化鈉
5. 0g
中性紅
0. 03g
結(jié)晶紫
0. 001g
瓊脂
15. 0g
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蒸餾水
1000mL
A. 3. 2  制法
將以上成分混合加熱溶解,校正
pH
至 7.
2±0. 2 。 121℃ 高壓滅菌 15min 。冷卻至 45℃~50℃ ,
傾注平板。
注:如不立即使用,在 2℃~8℃ 條件下可儲存兩周。
A. 4  伊紅美藍(lán)( EMB )瓊脂
A. 4. 1  成分
蛋白胨
10. 0g
乳糖
10. 0g
磷酸氫二鉀( K
2 HPO 4 ) 2. 0g
瓊脂
15. 0g
2% 伊紅 Y 水溶液 20. 0mL
0. 5% 美藍(lán)水溶液 13. 0mL
蒸餾水
1000mL
A. 4. 2  制法
在 1000mL 蒸餾水中煮沸溶解蛋白胨、磷酸鹽和乳糖,加水補足,冷卻至 25 ℃ 左右校正
pH
至
7. 1±0. 2 。再加入瓊脂, 121℃ 高壓滅菌 15min 。冷至 45℃~50℃ ,加入 2% 伊紅 Y 水溶液和 0. 5% 美
藍(lán)水溶液,搖勻,傾注平皿。
A. 5  三糖鐵瓊脂( TSI )
A. 5. 1  成分
蛋白胨
20. 0g
牛肉浸膏
5. 0g
乳糖
10. 0g
蔗糖
10. 0g
葡萄糖
1. 0g
硫酸亞鐵銨[( NH 4 )
2 Fe ( SO 4 ) 2 · 6H 2 O ] 0. 2g
氯化鈉
5. 0g
硫代硫酸鈉
0. 2g
酚紅
0. 025g
瓊脂
12. 0g
蒸餾水
1000mL
A. 5. 2  制法
除酚紅和瓊脂外,將其他成分加于 400mL 水中,攪拌均勻,靜置約 10min ,加熱使完全溶化,冷卻
至 25℃ 左右校正
pH
至 7.
4±0. 2 。另將瓊脂加于 600mL 水中,靜置約 10min ,加熱使完全溶化。將
兩溶液混合均勻,加入 5% 酚紅水溶液 5 mL ,混勻,分裝小號試管,每管約 3 mL 。于 121 ℃ 滅菌
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15min ,制成高層斜面。冷卻后呈桔紅色。如不立即使用,在 2℃~8℃ 條件下可儲存一個月。
A. 6  蛋白胨水、靛基質(zhì)試劑
A. 6. 1  成分
胰蛋白胨
20. 0g
氯化鈉
5. 0g
蒸餾水
1000mL
A. 6. 2  制法
將以上成分混合加熱溶解,冷卻至 25 ℃ 左右校正
pH
至 7.
4±0. 2 ,分裝小試管, 121 ℃ 高壓滅菌
15min 。
注:此試劑在 2℃~8℃ 條件下可儲存一個月。
A. 6. 3  靛基質(zhì)試劑
A. 6. 3. 1  柯凡克試劑:將 5g 對二甲氨基苯甲醛溶解于 75mL 戊醇中。然后緩慢加入濃鹽酸 25mL 。
A. 6. 3. 2  歐 - 波試劑:將 1g 對二甲氨基苯甲醛溶解于 95 mL95% 乙醇內(nèi)。然后緩慢加入濃鹽酸
20mL 。
A. 6. 4  試驗方法
挑取少量培養(yǎng)物接種,在 36℃±1℃ 培養(yǎng) 1d~2d ,必要時可培養(yǎng) 4d~5d 。加入柯凡克試劑約
0. 5mL ,輕搖試管,陽性者于試劑層呈深紅色;或加入歐 - 波試劑約 0. 5mL ,沿管壁流下,覆蓋于培養(yǎng)液
表面,陽性者于液面接觸處呈玫瑰紅色。
A. 7  半固體瓊脂
A. 7. 1  成分
蛋白胨
1. 0g
牛肉膏
0. 3g
氯化鈉
0. 5g
瓊脂
0. 3g~0. 5g
蒸餾水
100. 0mL
A. 7. 2  制法
按以上成分配好,加熱溶解,冷卻至 25 ℃ 左右校正
pH
至 7.
4±0. 2 ,分裝小試管。 121 ℃ 滅菌
15min ,直立凝固備用。
A. 8  尿素瓊脂( pH7. 2 )
A. 8. 1  成分
蛋白胨
1. 0g
氯化鈉
5. 0g
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葡萄糖
1. 0g
磷酸二氫鉀
2. 0g
0. 4% 酚紅 3. 0mL
瓊脂
20. 0g
20% 尿素溶液 100. 0mL
蒸餾水
1000mL
A. 8. 2  制法
除酚紅、尿素和瓊脂外的其他成分加熱溶解,冷卻至 25℃ 左右校正
pH
至 7.
2±0. 2 ,加入酚紅指示
劑,混勻,于 121℃ 滅菌 15min 。冷至約 55℃ ,加入用 0.
22 μ m 過濾膜除菌后的 20% 尿素水溶液 100
mL ,混勻,以無菌操作分裝滅菌試管,每管約 3mL~4mL ,制成斜面后放冰箱備用。
A. 8. 3  試驗方法
挑取瓊脂培養(yǎng)物接種,在 36℃±1℃ 培養(yǎng) 24h ,觀察結(jié)果。尿素酶陽性者由于產(chǎn)堿而使培養(yǎng)基變
為紅色。
A. 9  氰化鉀( KCN )培養(yǎng)基
A. 9. 1  成分
蛋白胨
10. 0g
氯化鈉
5. 0g
磷酸二氫鉀
0. 225g
磷酸氫二鈉
5. 64g
0. 5% 氰化鉀 20. 0mL
蒸餾水
1000mL
A. 9. 2  制法
將除氰化鉀以外的成分加入蒸餾水中,煮沸溶解,分裝后 121℃ 高壓滅菌 15min 。放在冰箱內(nèi)使
其充分冷卻。每 100mL 培養(yǎng)基加入 0.
5% 氰化鉀溶液 2. 0mL (最后濃度為 1∶10000 ),分裝于無菌試
管內(nèi),每管約 4mL ,立刻用無菌橡皮塞塞緊,放在 4℃ 冰箱內(nèi),至少可保存兩個月。同時,將不加氰化鉀
的培養(yǎng)基作為對照培養(yǎng)基,分裝試管備用。
A. 9. 3  試驗方法
將瓊脂培養(yǎng)物接種于蛋白胨水內(nèi)成為稀釋菌液,挑取 1 環(huán)接種于氰化鉀( KCN )培養(yǎng)基。并另挑取
1 環(huán)接種于對照培養(yǎng)基。在 36℃±1℃ 培養(yǎng) 1d~2d ,觀察結(jié)果。如有細(xì)菌生長即為陽性(不抑制),經(jīng)
2d 細(xì)菌不生長為陰性(抑制)。
注:氰化鉀是劇毒藥,使用時應(yīng)小心,切勿沾染,以免中毒。夏天分裝培養(yǎng)基應(yīng)在冰箱內(nèi)進(jìn)行。試驗失敗的主要原
因是封口不嚴(yán),氰化鉀逐漸分解,產(chǎn)生氫氰酸氣體逸出,以致藥物濃度降低,細(xì)菌生長,因而造成假陽性反應(yīng)。
試驗時對每一環(huán)節(jié)都要特別注意。
A. 10  氧化酶試劑
A. 10. 1  成分
N , N ’ - 二甲基對苯二胺鹽酸鹽或
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N , N , N ’, N ’ - 四甲基對苯二胺鹽酸鹽 1. 0g
蒸餾水
100mL
A. 10. 2  制法
少量新鮮配制,于 2℃~8℃ 冰箱內(nèi)避光保存,在 7d 內(nèi)使用。
A. 10. 3  試驗方法
用無菌棉拭子取單個菌落,滴加氧化酶試劑,
10s 內(nèi)呈現(xiàn)粉紅或紫紅色即為氧化酶試驗陽性,不變
色者為氧化酶試驗陰性。
A. 11  革蘭氏染色液
A. 11. 1  結(jié)晶紫染色液
A. 11. 1. 1  成分
結(jié)晶紫
1. 0g
95% 乙醇 20. 0mL
1% 草酸銨水溶液 80. 0mL
A. 11. 1. 2  制法
將結(jié)晶紫完全溶解于乙醇中,然后與草酸銨溶液混合。
A. 11. 2  革蘭氏碘液
A. 11. 2. 1  成分
碘
1. 0g
碘化鉀
2. 0g
蒸餾水
300mL
A. 11. 2. 2  制法
將碘與碘化鉀先行混合,加入蒸餾水少許充分振搖,待完全溶解后,再加蒸餾水至 300mL 。
A. 11. 3  沙黃復(fù)染液
A. 11. 3. 1  成分
沙黃
0. 25g
95% 乙醇 10. 0mL
蒸餾水
90. 0mL
A. 11. 3. 2  制法
將沙黃溶解于乙醇中,然后用蒸餾水稀釋。
A. 11. 4  染色法
A. 11. 4. 1  涂片在火焰上固定,滴加結(jié)晶紫染液,染 1min ,水洗。
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A. 11. 4. 2  滴加革蘭氏碘液,作用 1min ,水洗。
A. 11. 4. 3  滴加 95% 乙醇脫色約 15s~30s ,直至染色液被洗掉,不要過分脫色,水洗。
A. 11. 4. 4  滴加復(fù)染液,復(fù)染 1min ,水洗、待干、鏡檢。
A. 12 BHI 肉湯
A. 12. 1  成分
小牛腦浸液
200g
牛心浸液
250g
蛋白胨
10. 0g
NaCl 5. 0g
葡萄糖
2. 0g
磷酸氫二鈉( Na
2 HPO 4 ) 2. 5g
蒸餾水
1000mL
A. 12. 2  制法
按以上成分配好,加熱溶解,冷卻至 25 ℃ 左右校正
pH
至 7.4±0.
2 ,分裝小試管。 121 ℃ 滅菌
15min 。
A. 13 TE ( pH8. 0 )
A. 13. 1  成分
1mol
/ LTris-HCl (
pH8. 0 )
10. 0mL
0. 5mol
/ LEDTA (
pH8. 0 )
2. 0mL
滅菌去離子水
988mL
A. 13. 2  制法
將 1mol / LTris-HCl 緩沖液(
pH8. 0 )、 0. 5mol / LEDTA 溶液(
pH8. 0 )加入約 800mL 滅菌去離子
水均勻,再定容至 1000mL ,
121℃ 高壓滅菌 15min , 4℃ 保存。
A. 14 10×PCR 反應(yīng)緩沖液
A. 14. 1  成分
1mol
/ LTris-HCl (
pH8. 5 )
840mL
氯化鉀( KCl )
37. 25g
滅菌去離子水
160mL
A. 14. 2  制法
將氯化鉀溶于 1mol / LTris-HCl (
pH8. 5 ),定容至 1000mL ,
121℃ 高壓滅菌 15min ,分裝后 -20℃
保存。
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A. 15 50×TAE 電泳緩沖液
A. 15. 1  成分
Tris 242. 0g
EDTA-2Na ( Na 2 EDTA · 2H 2 O ) 37. 2g
冰乙酸(
CH 3 COOH ) 57. 1mL
滅菌去離子水
942. 9mL
A. 15. 2  制法
Tris 和 EDTA-2Na 溶于 800mL 滅菌去離子水,充分?jǐn)嚢杈鶆?加入冰乙酸,充分溶解;用 1mol
/ l
NaOH 調(diào)
pH
至 8.
3 ,定容至 1L 后,室溫保存。使用時稀釋 50 倍即為 1×TAE 電泳緩沖液。
A. 16 6× 上樣緩沖液
A. 16. 1  成分
溴酚藍(lán)
0. 5g
二甲苯氰 FF
0. 5g
0. 5mol
/ LEDTA (
pH8. 0 )
0. 06mL
甘油
360mL
滅菌去離子水
640mL
A. 16. 2  制法
0. 5mol
/ LEDTA (
pH8. 0 )溶于 500mL 滅菌去離子水中,加入溴酚藍(lán)和二甲苯氰 FF 溶解,與甘油
混合,定容至 1000mL ,分裝后 4℃ 保存。