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中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)
GB 4789.7—2013
食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)
食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 副溶血性弧菌檢驗(yàn)
2013-11-29 發(fā)布  2014-06-01 實(shí)施
GB 4789.7—2013
I
前 言
本標(biāo)準(zhǔn)代替GB/T 4789.7-2008《食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn) 副溶血性弧菌檢驗(yàn)》。
本標(biāo)準(zhǔn)與GB/T 4789.7-2008相比，主要變化如下：
——修改了標(biāo)準(zhǔn)的中文名稱；
——修改了范圍；
——修改了設(shè)備和材料；
——修改了培養(yǎng)基和試劑；
——修改了樣品制備過程；
——修改了檢驗(yàn)程序。
GB 4789.7—2013
1
食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)
食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 副溶血性弧菌檢驗(yàn)
1 范圍
本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了食品中副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus）的檢驗(yàn)方法。
本標(biāo)準(zhǔn)適用于食品中副溶血性弧菌的檢驗(yàn)。
2 設(shè)備和材料
除微生物實(shí)驗(yàn)室常規(guī)滅菌及培養(yǎng)設(shè)備外，其他設(shè)備和材料如下：
a) 恒溫培養(yǎng)箱：36 ℃±1 ℃；
b) 冰箱：2 ℃～5 ℃、7 ℃～10 ℃；
c) 恒溫水浴箱：36 ℃±1 ℃；
d) 均質(zhì)器或無菌乳缽；
e) 天平：感量 0.1 g；
f) 無菌試管：18 mm×180 mm、15 mm×100 mm；
g) 無菌吸管：1 mL（具 0.01 mL 刻度）、10 mL（具 0.1 mL 刻度）或微量移液器及吸頭；
h) 無菌錐形瓶：容量 250 mL、500 mL、1000 mL；
i) 無菌培養(yǎng)皿：直徑 90 mm；
j) 全自動(dòng)微生物生化鑒定系統(tǒng)；
k) 無菌手術(shù)剪、鑷子。
3 培養(yǎng)基和試劑
3.1 3％氯化鈉堿性蛋白胨水：見附錄 A 中 A.1。
3.2 硫代硫酸鹽-檸檬酸鹽-膽鹽-蔗糖（TCBS）瓊脂：見附錄 A 中 A.2。
3.3 3％氯化鈉胰蛋白胨大豆瓊脂：見附錄 A 中 A.3。
3.4 3％氯化鈉三糖鐵瓊脂：見附錄 A 中 A.4。
3.5 嗜鹽性試驗(yàn)培養(yǎng)基：見附錄 A 中 A.5。
3.6 3％氯化鈉甘露醇試驗(yàn)培養(yǎng)基：見附錄 A 中 A.6。
3.7 3％氯化鈉賴氨酸脫羧酶試驗(yàn)培養(yǎng)基：見附錄 A 中 A.7。
3.8 3％氯化鈉 MR-VP 培養(yǎng)基：見附錄 A 中 A.8。
3.9 3％氯化鈉溶液：見附錄 A 中 A.9。
3.10 我妻氏血瓊脂：見附錄 A 中 A.10。
3.11 氧化酶試劑：見附錄 A 中 A.11。
3.12 革蘭氏染色液：見附錄 A 中 A.12。
3.13 ONPG 試劑：見附錄 A 中 A.13。
3.14 Voges-Proskauer（V-P）試劑：見附錄 A 中 A.14。
3.15 弧菌顯色培養(yǎng)基。
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2
3.16 生化鑒定試劑盒。
4 檢驗(yàn)程序
副溶血性弧菌檢驗(yàn)程序見圖1。
圖1 副溶血性弧菌檢驗(yàn)程序
5 操作步驟
5.1 樣品制備
5.1.1 非冷凍樣品采集后應(yīng)立即置 7 ℃～10 ℃冰箱保存，盡可能及早檢驗(yàn)；冷凍樣品應(yīng)在 45 ℃以下不
超過 15 min 或在 2 ℃～5 ℃不超過 18 h 解凍。
5.1.2 魚類和頭足類動(dòng)物取表面組織、腸或鰓。貝類取全部內(nèi)容物，包括貝肉和體液；甲殼類取整個(gè)動(dòng)
物，或者動(dòng)物的中心部分，包括腸和鰓。如為帶殼貝類或甲殼類，則應(yīng)先在自來水中洗刷外殼并甩干表
面水分，然后以無菌操作打開外殼，按上述要求取相應(yīng)部分。
定量  定性
36 ℃±1 ℃，8 h～18 h
36 ℃±1 ℃，18 h～24 h
36 ℃±1 ℃，18 h～24 h
36 ℃±1 ℃，8 h～18 h
樣品 25 g（mL）+225 mL 3%氯化鈉堿性蛋白胨水
接種 3%氯化鈉堿性蛋白胨水
3 管，3 個(gè)適宜的連續(xù)稀釋度
挑取可疑菌落，接種于 3％氯化鈉胰蛋白胨大豆瓊脂
生化試驗(yàn)或選用生化鑒定試劑盒或全自動(dòng)微生
物生化鑒定系統(tǒng)
結(jié)果與報(bào)告
血清學(xué)試驗(yàn)、神奈川試驗(yàn)
（選做項(xiàng)目）
TCBS 或弧菌顯色培養(yǎng)基
篩選試驗(yàn)
氧化酶試驗(yàn)，革蘭氏染色，
3％氯化鈉三糖鐵瓊脂，嗜鹽性試驗(yàn)
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3
5.1.3 以無菌操作取樣品 25 g（mL），加入 3%氯化鈉堿性蛋白胨水 225 mL，用旋轉(zhuǎn)刀片式均質(zhì)器以
8 000 r/min 均質(zhì) 1 min，或拍擊式均質(zhì)器拍擊 2 min，制備成 1:10 的樣品勻液。如無均質(zhì)器，則將樣品放
入無菌乳缽，自 225 mL 3%氯化鈉堿性蛋白胨水中取少量稀釋液加入無菌乳缽，樣品磨碎后放入 500 mL
無菌錐形瓶，再用少量稀釋液沖洗乳缽中的殘留樣品 1～2 次，洗液放入錐形瓶，最后將剩余稀釋液全部
放入錐形瓶，充分振蕩，制備 1:10 的樣品勻液。
5.2 增菌
5.2.1 定性檢測
將 5.1.3 制備的 1:10 樣品勻液于 36 ℃±1 ℃培養(yǎng) 8 h～18 h。
5.2.2 定量檢測
5.2.2.1 用無菌吸管吸取 1:10 樣品勻液 1 mL，注入含有 9 mL 3%氯化鈉堿性蛋白胨水的試管內(nèi)，振搖
試管混勻，制備 1:100 的樣品勻液。
5.2.2.2 另取 1 mL 無菌吸管，按 5.2.2.1 操作程序，依次制備 10 倍系列稀釋樣品勻液，每遞增稀釋一
次，換用一支 1 mL 無菌吸管。
5.2.2.3 根據(jù)對檢樣污染情況的估計(jì)，選擇 3 個(gè)適宜的連續(xù)稀釋度，每個(gè)稀釋度接種 3 支含有 9 mL 3%
氯化鈉堿性蛋白胨水的試管，每管接種 1 mL。置 36 ℃±1 ℃恒溫箱內(nèi)，培養(yǎng) 8 h～18 h。
5.3 分離
5.3.1 對所有顯示生長的增菌液，用接種環(huán)在距離液面以下 1 cm 內(nèi)沾取一環(huán)增菌液，于 TCBS 平板或
弧菌顯色培養(yǎng)基平板上劃線分離。一支試管劃線一塊平板。于 36 ℃±1 ℃培養(yǎng) 18 h～24 h。
5.3.2 典型的副溶血性弧菌在 TCBS 上呈圓形、半透明、表面光滑的綠色菌落，用接種環(huán)輕觸，有類似
口香糖的質(zhì)感，直徑 2 mm～3 mm。從培養(yǎng)箱取出 TCBS 平板后，應(yīng)盡快（不超過 1 h）挑取菌落或標(biāo)記
要挑取的菌落。典型的副溶血性弧菌在弧菌顯色培養(yǎng)基上的特征按照產(chǎn)品說明進(jìn)行判定。
5.4 純培養(yǎng)
挑取 3 個(gè)或以上可疑菌落，劃線接種 3%氯化鈉胰蛋白胨大豆瓊脂平板，36 ℃±1 ℃培養(yǎng) 18 h～24
h。
5.5 初步鑒定
5.5.1 氧化酶試驗(yàn)：挑選純培養(yǎng)的單個(gè)菌落進(jìn)行氧化酶試驗(yàn)，副溶血性弧菌為氧化酶陽性。
5.5.2 涂片鏡檢：將可疑菌落涂片，進(jìn)行革蘭氏染色，鏡檢觀察形態(tài)。副溶血性弧菌為革蘭氏陰性，呈
棒狀、弧狀、卵圓狀等多形態(tài)，無芽胞，有鞭毛。
5.5.3 挑取純培養(yǎng)的單個(gè)可疑菌落，轉(zhuǎn)種 3%氯化鈉三糖鐵瓊脂斜面并穿刺底層，36 ℃±1 ℃培養(yǎng) 24 h
觀察結(jié)果。副溶血性弧菌在 3%氯化鈉三糖鐵瓊脂中的反應(yīng)為底層變黃不變黑，無氣泡，斜面顏色不變
或紅色加深，有動(dòng)力。
5.5.4 嗜鹽性試驗(yàn)：挑取純培養(yǎng)的單個(gè)可疑菌落，分別接種 0%、6%、8%和 10%不同氯化鈉濃度的胰
胨水，36 ℃±1 ℃培養(yǎng) 24 h，觀察液體混濁情況。副溶血性弧菌在無氯化鈉和 10%氯化鈉的胰胨水中不
生長或微弱生長，在 6%氯化鈉和 8%氯化鈉的胰胨水中生長旺盛。
5.6 確定鑒定
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取純培養(yǎng)物分別接種含 3%氯化鈉的甘露醇試驗(yàn)培養(yǎng)基、賴氨酸脫羧酶試驗(yàn)培養(yǎng)基、MR-VP 培養(yǎng)基，
36 ℃±1 ℃培養(yǎng) 24 h～48 h 后觀察結(jié)果；3%氯化鈉三糖鐵瓊脂隔夜培養(yǎng)物進(jìn)行 ONPG 試驗(yàn)�？蛇x擇生化
鑒定試劑盒或全自動(dòng)微生物生化鑒定系統(tǒng)。
6 血清學(xué)分型（選做項(xiàng)目）
6.1 制備
接種兩管 3%氯化鈉胰蛋白胨大豆瓊脂試管斜面，36 ℃±1 ℃培養(yǎng) 18 h～24 h。用含 3%氯化鈉的 5%
甘油溶液沖洗 3%氯化鈉胰蛋白胨大豆瓊脂斜面培養(yǎng)物，獲得濃厚的菌懸液。
6.2 K 抗原的鑒定
取一管 6.1 制備好的菌懸液，首先用多價(jià) K 抗血清進(jìn)行檢測，出現(xiàn)凝集反應(yīng)時(shí)再用單個(gè)的抗血清進(jìn)
行檢測。用蠟筆在一張玻片上劃出適當(dāng)數(shù)量的間隔和一個(gè)對照間隔。在每個(gè)間隔內(nèi)各滴加一滴菌懸液，
并對應(yīng)加入一滴 K 抗血清。在對照間隔內(nèi)加一滴 3%氯化鈉溶液。輕微傾斜玻片，使各成分相混合，再
前后傾動(dòng)玻片 1 min。陽性凝集反應(yīng)可以立即觀察到。
6.3 O 抗原的鑒定
將另外一管的菌懸液轉(zhuǎn)移到離心管內(nèi)，121 ℃滅菌 1 h。滅菌后 4 000 r/min 離心 15 min，棄去上層液
體，沉淀用生理鹽水洗三次，每次 4 000 r/min 離心 15 min，最后一次離心后留少許上層液體，混勻制成
菌懸液。用蠟筆將玻片劃分成相等的間隔。在每個(gè)間隔內(nèi)加入一滴菌懸液，將 O 群血清分別加一滴到間
隔內(nèi)，最后一個(gè)間隔加一滴生理鹽水作為自凝對照。輕微傾斜玻片，使各成分相混合，再前后傾動(dòng)玻片
1 min。陽性凝集反應(yīng)可以立即觀察到。如果未見到與 O 群血清的凝集反應(yīng)，將菌懸液 121 ℃再次高壓 1
h 后，重新檢測。如果仍為陰性，則培養(yǎng)物的 O 抗原屬于未知。根據(jù)表 1 報(bào)告血清學(xué)分型結(jié)果。
表 1 副溶血性弧菌的抗原
O 群  K 型
1  1，5，20，25，26，32，38，41，56，58，60，64，69
2  3，28
3  4，5，6，7，25，29，30，31，33，37，43，45，48，54，56，57，58，59，72，75
4  4，8，9，10，11，12，13，34，42，49，53，55，63，67，68，73
5  15，17，30，47，60，61，68
6  18，46
7  19
8  20，21，22，39，41，70，74
9  23，44
10  24，71
11  19，36，40，46，50，51，61
12  19，52，61，66
13  65
7 神奈川試驗(yàn)（選做項(xiàng)目）
神奈川試驗(yàn)是在我妻氏瓊脂上測試是否存在特定溶血素。神奈川試驗(yàn)陽性結(jié)果與副溶血性弧菌分離
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株的致病性顯著相關(guān)。
用接種環(huán)將測試菌株的 3%氯化鈉胰蛋白胨大豆瓊脂 18 h 培養(yǎng)物點(diǎn)種于表面干燥的我妻氏血瓊脂平
板。每個(gè)平板上可以環(huán)狀點(diǎn)種幾個(gè)菌。36 ℃±1 ℃培養(yǎng)不超過 24 h，并立即觀察。陽性結(jié)果為菌落周圍
呈半透明環(huán)的 β 溶血。
8 結(jié)果與報(bào)告
根據(jù)檢出的可疑菌落生化性狀，報(bào)告 25 g（mL）樣品中檢出副溶血性弧菌。如果進(jìn)行定量檢測，根
據(jù)證實(shí)為副溶血性弧菌陽性的試管管數(shù)，查最可能數(shù)（MPN）檢索表，報(bào)告每 g（mL）副溶血性弧菌的
MPN 值。副溶血性弧菌菌落生化性狀和與其他弧菌的鑒別情況分別見表 2 和表 3。
表 2 副溶血性弧菌的生化性狀
試驗(yàn)項(xiàng)目  結(jié)果
革蘭氏染色鏡檢  陰性，無芽胞
氧化酶  ＋
動(dòng)力  ＋
蔗糖  －
葡萄糖  ＋
甘露醇  ＋
分解葡萄糖產(chǎn)氣  －
乳糖  －
硫化氫  －
賴氨酸脫羧酶  ＋
V-P  －
ONPG  －
注：＋表示陽性；－表示陰性。
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表 3 副溶血性弧菌主要性狀與其他弧菌的鑒別
名稱
氧
化
酶
賴
氨
酸
精
氨
酸
鳥
氨
酸
明
膠
脲
酶
V
︱
P
42℃
生長
蔗
糖
D
︱
纖
維
二
糖
乳
糖
阿
拉
伯
糖
D
︱
甘
露
糖
D
︱
甘
露
醇
ONPG
嗜鹽性試驗(yàn)
氯化鈉含量
%
0  3  6  8  10
副溶血性弧菌
V.
parahaemolyticus
＋  ＋  －  ＋  ＋  V  －  ＋  －  V  －  ＋  ＋  ＋  －  －  ＋  ＋  ＋  －
創(chuàng)傷弧菌
V. vulnificus
＋  ＋  －  ＋  ＋  －  －  ＋  －  ＋  ＋  －  ＋  V  ＋  －  ＋  ＋  －  －
溶藻弧菌
V. alginolyticus
＋  ＋  －  ＋  ＋  －  ＋  ＋  ＋  －  －  －  ＋  ＋  －  －  ＋  ＋  ＋  ＋
霍亂弧菌
V. cholerae
＋  ＋  －  ＋  ＋  －  V  ＋  ＋  －  －  －  ＋  ＋  ＋  ＋  ＋  －  －  －
擬態(tài)弧菌
V. mimicus
＋  ＋  －  ＋  ＋  －  －  ＋  －  －  －  －  ＋  ＋  ＋  ＋  ＋  －  －  －
河弧菌
V. fluvialis
＋  －  ＋  －  ＋  －  －  V  ＋  ＋  －  ＋  ＋  ＋  ＋  －  ＋  ＋  V  －
弗氏弧菌
V. furnissii
＋  －  ＋  －  ＋  －  －  －  ＋  －  －  ＋  ＋  ＋  ＋  －  ＋  ＋  ＋  －
梅氏弧菌
V. metschnikovii
－  ＋  ＋  －  ＋  －  ＋  V  ＋  －  －  －  ＋  ＋  ＋  －  ＋  ＋  V  －
霍利斯弧菌
V. hollisae
＋  －  －  －  －  －  －  nd  －  －  －  ＋  ＋  －  －  －  ＋  ＋  －  －
注：＋表示陽性；－表示陰性；nd 表示未試驗(yàn)；V 表示可變。
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附錄A
培養(yǎng)基與試劑
A.1 3％氯化鈉堿性蛋白胨水
A.1.1 成分
蛋白胨  10.0 g
氯化鈉  30.0 g
蒸餾水  1 000.0 mL
A.1.2 制法
將 A.1.1 中成分溶于蒸餾水中，校正 pH 至 8.5±0.2，121 ℃高壓滅菌 10 min。
A.2 硫代硫酸鹽-檸檬酸鹽-膽鹽-蔗糖（TCBS）瓊脂
A.2.1 成分
蛋白胨  10.0 g
酵母浸膏  5.0 g
檸檬酸鈉（C 6 H 5 O 7 Na 3 ˙ 2H 2 O）  10.0 g
硫代硫酸鈉（Na 2 S 2 O 3 ˙ 5H 2 O）  10.0 g
氯化鈉  10.0 g
牛膽汁粉  5.0 g
檸檬酸鐵  1.0 g
膽酸鈉  3.0 g
蔗糖  20.0 g
溴麝香草酚藍(lán)  0.04 g
麝香草酚藍(lán)  0.04 g
瓊脂  15.0 g
蒸餾水  1 000.0 mL
A.2.2 制法
將 A.2.1 中成分溶于蒸餾水中，校正 pH 至 8.6±0.2，加熱煮沸至完全溶解。冷至 50 ℃左右傾注平
板備用。
A.3 3％氯化鈉胰蛋白胨大豆瓊脂
A.3.1 成分
胰蛋白胨  15.0 g
大豆蛋白胨  5.0 g
氯化鈉  30.0 g
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8
瓊脂  15.0 g
蒸餾水  1 000.0 mL
A.3.2 制法
將 A.3.1 中成分溶于蒸餾水中，校正 pH 至 7.3±0.2，121 ℃高壓滅菌 15 min。
A.4 3％氯化鈉三糖鐵瓊脂
A.4.1 成分
蛋白胨  15.0 g
䏡蛋白胨  5.0 g
牛肉膏  3.0 g
酵母浸膏  3.0 g
氯化鈉  30.0 g
乳糖  10.0 g
蔗糖  10.0 g
葡萄糖  1.0 g
硫酸亞鐵（FeSO 4 ）  0.2 g
苯酚紅  0.024 g
硫代硫酸鈉（Na 2 S 2 O 3 ）  0.3 g
瓊脂  12.0 g
蒸餾水  1 000.0 mL
A.4.2 制法
將A.4.1中成分溶于蒸餾水中，校正pH至7.4±0.2。分裝到適當(dāng)容量的試管中。121 ℃高壓滅菌15 min。
制成高層斜面，斜面長4 cm～5 cm，高層深度為2 cm～3 cm。
A.5 嗜鹽性試驗(yàn)培養(yǎng)基
A.5.1 成分
胰蛋白胨  10.0 g
氯化鈉  按不同量加入
蒸餾水  1 000.0 mL
A.5.2 制法
將 A.5.1 中成分溶于蒸餾水中，校正 pH 至 7.2±0.2，共配制 5 瓶，每瓶 100 mL。每瓶分別加入不
同量的氯化鈉：（1）不加；（2）3 g；（3）6 g；（4）8g；（5）10 g。分裝試管，121 ℃高壓滅菌 15 min。
A.6 3％氯化鈉甘露醇試驗(yàn)培養(yǎng)基
A.6.1 成分
牛肉膏  5.0 g
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蛋白胨  10.0 g
氯化鈉  30.0 g
磷酸氫二鈉（Na 2 HPO 4 ˙ 12H 2 O）  2.0 g
甘露醇  5.0g
溴麝香草酚藍(lán)  0.024 g
蒸餾水  1 000.0 mL
A.6.2 制法
將 A.6.1 中成分溶于蒸餾水中，校正 pH 至 7.4±0.2，分裝小試管，121 ℃高壓滅菌 10 min。
A.6.3 試驗(yàn)方法
從瓊脂斜面上挑取培養(yǎng)物接種，于 36 ℃±1 ℃培養(yǎng)不少于 24 h，觀察結(jié)果。甘露醇陽性者培養(yǎng)物呈
黃色，陰性者為綠色或藍(lán)色。
A.7 3％氯化鈉賴氨酸脫羧酶試驗(yàn)培養(yǎng)基
A.7.1 成分
蛋白胨  5.0 g
酵母浸膏  3.0 g
葡萄糖  1.0 g
溴甲酚紫  0.02 g
L-賴氨酸  5.0 g
氯化鈉  30.0 g
蒸餾水  1 000.0 mL
A.7.2 制法
除賴氨酸以外的成分溶于蒸餾水中，校正 pH 至 6.8±0.2。再按 0.5％的比例加入賴氨酸，對照培養(yǎng)
基不加賴氨酸。分裝小試管，每管 0.5 mL，121 ℃高壓滅菌 15 min。
A.7.3 試驗(yàn)方法
從瓊脂斜面上挑取培養(yǎng)物接種，于 36 ℃±1 ℃培養(yǎng)不少于 24 h，觀察結(jié)果。賴氨酸脫羧酶陽性者
由于產(chǎn)堿中和葡萄糖產(chǎn)酸，故培養(yǎng)基仍應(yīng)呈紫色。陰性者無堿性產(chǎn)物，但因葡萄糖產(chǎn)酸而使培養(yǎng)基變?yōu)?br /> 黃色。對照管應(yīng)為黃色。
A.8 3％氯化鈉MR-VP培養(yǎng)基
A.8.1 成分
多胨  7.0 g
葡萄糖  5.0 g
磷酸氫二鉀（K 2 HPO 4 ）  5.0 g
氯化鈉  30.0 g
蒸餾水  1 000.0 mL
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A.8.2 制法
將 A.8.1 中成分溶于蒸餾水中，校正 pH 至 6.9±0.2，分裝試管，121 ℃高壓滅菌 15 min。
A.9 3％氯化鈉溶液
A.9.1 成分
氯化鈉  30.0 g
蒸餾水  1 000.0 mL
A.9.2 制法
將氯化鈉溶于蒸餾水中，校正 pH 至 7.2±0.2，121 ℃高壓滅菌 15 min。
A.10 我妻氏血瓊脂
A.10.1 成分
酵母浸膏  3.0 g
蛋白胨  10.0 g
氯化鈉  70.0 g
磷酸氫二鉀（K 2 HPO 4 ）  5.0 g
甘露醇  10.0 g
結(jié)晶紫  0.001 g
瓊脂  15.0 g
蒸餾水  1 000.0 mL
A.10.2 制法
將 A.10.1 中成分溶于蒸餾水中，校正 pH 至 8.0±0.2，加熱至 100 ℃，保持 30 min，冷至 45 ℃～
50 ℃，與 50 mL 預(yù)先洗滌的新鮮人或兔紅細(xì)胞（含抗凝血?jiǎng)�）混合，傾注平板。干燥平板，盡快使用。
A.11 氧化酶試劑
A.11.1 成分
N,N,N',N'-四甲基對苯二胺鹽酸鹽  1.0 g
蒸餾水  100.0 mL
A.11.2 制法
將 N , N , N ', N '-四甲基對苯二胺鹽酸鹽溶于蒸餾水中，2 ℃～5 ℃冰箱內(nèi)避光保存，在7 d之內(nèi)使用。
A.11.3 試驗(yàn)方法
用細(xì)玻璃棒或一次性接種針挑取新鮮（24 h）菌落，涂布在氧化酶試劑濕潤的濾紙上。如果濾紙?jiān)?br /> 10 s 之內(nèi)呈現(xiàn)粉紅或紫紅色，即為氧化酶試驗(yàn)陽性。不變色為氧化酶試驗(yàn)陰性。
A.12 革蘭氏染色液
GB 4789.7—2013
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A.12.1 結(jié)晶紫染色液
A.12.1.1 成分
結(jié)晶紫  1.0 g
95％乙醇  20.0 mL
1％草酸銨水溶液  80.0 mL
A.12.1.2 制法
將結(jié)晶紫完全溶解于乙醇中，然后與草酸銨溶液混合。
A.12.2 革蘭氏碘液
A.12.2.1 成分
碘  1.0 g
碘化鉀  2.0 g
蒸餾水  300.0 mL
A.12.2.2 制法
將碘與碘化鉀先進(jìn)行混合，加入蒸餾水少許充分振搖，待完全溶解后，再加蒸餾水至 300 mL。
A.12.3 沙黃復(fù)染液
A.12.3.1 成分
沙黃  0.25 g
95％乙醇  10.0 mL
蒸餾水  90.0 mL
A.12.3.2 制法
將沙黃溶解于乙醇中，然后用蒸餾水稀釋。
A.12.4 染色法
A.12.4.1 將涂片在酒精燈火焰上固定，滴加結(jié)晶紫染色液，染 1 min，水洗。
A.12.4.2 滴加革蘭氏碘液，作用 1 min，水洗。
A.12.4.3 滴加 95%乙醇脫色，約 15 s～30 s，直至染色液被洗掉，不要過分脫色，水洗。
A.12.4.4 滴加復(fù)染液，復(fù)染 1 min。水洗、待干、鏡檢。
A.13 ONPG試劑
A.13.1 緩沖液
A.13.1.1 成分
磷酸二氫鈉（NaH 2 PO 4 ˙ H 2 O）  6.9 g
蒸餾水加至  50.0 mL
A.13.1.2 制法
GB 4789.7—2013
12
將磷酸二氫鈉溶于蒸餾水中，校正pH至7.0。緩沖液置2 ℃～5 ℃冰箱保存。
A.13.2 ONPG溶液
A.13.2.1 成分
鄰硝基酚-β-D-半乳糖苷（ONPG）  0.08 g
蒸餾水  15.0 mL
緩沖液  5.0 mL
A.13.2.2 制法
將 ONPG 在 37 ℃的蒸餾水中溶解，加入緩沖液。ONPG 溶液置 2 ℃～5 ℃冰箱保存。試驗(yàn)前，將
所需用量的 ONPG 溶液加熱至 37 ℃。
A.13.3 試驗(yàn)方法
將待檢培養(yǎng)物接種 3%氯化鈉三糖鐵瓊脂， 36 ℃±1 ℃培養(yǎng) 18 h。挑取 1 滿環(huán)新鮮培養(yǎng)物接種于 0.25
mL 3%氯化鈉溶液，在通風(fēng)櫥中，滴加 1 滴甲苯，搖勻后置 37 ℃水浴 5 min。加 0.25 mL ONPG 溶液，
36 ℃±1 ℃培養(yǎng)觀察 24 h。陽性結(jié)果呈黃色。陰性結(jié)果則 24 h 不變色。
A.14 Voges-Proskauer（V-P）試劑
A.14.1 成分
甲液 
α-萘酚  5.0 g
無水乙醇  100.0 mL
乙液 
氫氧化鉀  40.0 g
用蒸餾水加至  100.0 mL
A.14.2 試驗(yàn)方法
將3%氯化鈉胰蛋白胨大豆瓊脂生長物接種3%氯化鈉MR-VP培養(yǎng)基，36 ℃±1 ℃培養(yǎng)48 h。取1 mL培
養(yǎng)物，轉(zhuǎn)放到一個(gè)試管內(nèi)，加0.6 mL甲液，搖動(dòng)。加0.2 mL乙液，搖動(dòng)。加入3 mg肌酸結(jié)晶，4 h后觀察
結(jié)果。陽性結(jié)果呈現(xiàn)伊紅的粉紅色。
GB 4789.7—2013
13
附錄 B
副溶血性弧菌最可能數(shù)（MPN）檢索表
每g（mL）檢樣中副溶血性弧菌最可能數(shù)（MPN）的檢索見表B.1。
表B.1 副溶血性弧菌最可能數(shù)（MPN）檢索表
陽性管數(shù)
MPN
95%可信限  陽性管數(shù)
MPN
95%可信限
0.10  0.01  0.001  下限  上限  0.10  0.01  0.001  下限  上限
0  0  0  <3.0  —  9.5  2  2  0  21  4.5  42
0  0  1  3.0  0.15  9.6  2  2  1  28  8.7  94
0  1  0  3.0  0.15  11  2  2  2  35  8.7  94
0  1  1  6.1  1.2  18  2  3  0  29  8.7  94
0  2  0  6.2  1.2  18  2  3  1  36  8.7  94
0  3  0  9.4  3.6  38  3  0  0  23  4.6  94
1  0  0  3.6  0.17  18  3  0  1  38  8.7  110
1  0  1  7.2  1.3  18  3  0  2  64  17  180
1  0  2  11  3.6  38  3  1  0  43  9  180
1  1  0  7.4  1.3  20  3  1  1  75  17  200
1  1  1  11  3.6  38  3  1  2  120  37  420
1  2  0  11  3.6  42  3  1  3  160  40  420
1  2  1  15  4.5  42  3  2  0  93  18  420
1  3  0  16  4.5  42  3  2  1  150  37  420
2  0  0  9.2  1.4  38  3  2  2  210  40  430
2  0  1  14  3.6  42  3  2  3  290  90  1,000
2  0  2  20  4.5  42  3  3  0  240  42  1,000
2  1  0  15  3.7  42  3  3  1  460  90  2,000
2  1  1  20  4.5  42  3  3  2  1100  180  4,100
2  1  2  27  8.7  94  3  3  3  >1100  420  —
注 1：本表采用 3 個(gè)稀釋度[0.1 g(mL)、0.01 g(mL)和 0.001 g(mL)]，每個(gè)稀釋度接種 3 管。
注 2：表內(nèi)所列檢樣量如改用 l g(mL）、0.1 g(mL)和 0.01 g(mL)時(shí)，表內(nèi)數(shù)字應(yīng)相應(yīng)降低 10 倍；如改用 0.01 g(mL)、
0.001 g(mL)、0.0001 g(mL)時(shí)，則表內(nèi)數(shù)字應(yīng)相應(yīng)增加 10 倍，其余類推。