近年來，CRISPR/Cas介導(dǎo)的植物基因組定點編輯技術(shù)在農(nóng)作物基因功能研究和精準育種中發(fā)揮了重要作用，展現(xiàn)了廣闊的發(fā)展?jié)摿�和�?yīng)用前景。然而，CRISPR/Cas介導(dǎo)的植物基因組定點敲除技術(shù)只能在基因組特定位點產(chǎn)生隨機插入和刪除，精準的片段插入和替換的效率一直很低，極大地限制了其在植物研究和育種上的應(yīng)用。因此，迫切需要建立更高效的植物基因組片段插入和替換技術(shù)體系。

由中國科院上海植物逆境生物學(xué)研究中心/中國科學(xué)院上海分子植物科學(xué)卓越創(chuàng)新中心朱健康院士領(lǐng)銜的研究團隊在植物基因組編輯領(lǐng)域再次取得重要進展。研究人員采用修飾后的DNA片段作為供體，在水稻上建立了一種高效的片段靶向敲入和替換技術(shù)，高至50%的靶向敲入效率將極大地方便植物的研究和育種。

植物基因組編輯是朱健康實驗室的重點研究領(lǐng)域，他們在近幾年來獲得了一系列的進展。作為該領(lǐng)域的重大難題，片段的靶向敲入和替換一直是他們的一個重要研究目標，也一直在圍繞這一目標努力。在成功地建立了病毒介導(dǎo)的同源重組（HDR）和各類單堿基編輯技術(shù)等多種方法的同時，他們也開始嘗試在供體DNA片段上尋找突破點，以克服現(xiàn)有方法效率低、應(yīng)用范圍窄等缺陷。核酸修飾在人的RNAi療法和核酸疫苗等醫(yī)學(xué)領(lǐng)域有廣泛的應(yīng)用。

朱健康課題組通過嘗試，發(fā)現(xiàn)將供體片段同時進行硫代修飾和磷酸化修飾后，能極大地增強CRISPR/Cas9引導(dǎo)的靶向敲入效率。他們先后在14個基因位點上成功靶向敲入了各類調(diào)控元件，包括翻譯增強子、轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件，甚至整個啟動子，供體片段最長達2049bp。通過對1393株各類T0代基因編輯水稻植株的分析發(fā)現(xiàn)，該方法的敲入效率可高達47.3%，平均效率為25%。高效的敲入效率甚至可以同時在四個位點上實現(xiàn)多基因靶向敲入�？梢灶A(yù)計，該技術(shù)的建立將使靶向敲入成為一項和靶向敲除一樣的常規(guī)實驗，被各個植物研究和育種單位廣泛應(yīng)用。
在此基礎(chǔ)上，朱健康研究團隊又巧妙地設(shè)計了一種片段精準替換的策略，稱之為重復(fù)片段介導(dǎo)的同源重組（TR-HDR）方法。常規(guī)的HDR頻率極其低下，但他們在前期的實驗中發(fā)現(xiàn)，基因組上串聯(lián)重復(fù)片段間的HDR頻率非常高。

他們利用現(xiàn)象，通過將修飾的片段靶向敲入至目標位點后，人為制造這種串聯(lián)重復(fù)結(jié)構(gòu)，誘導(dǎo)TR-HDR去實現(xiàn)片段替換。采用該技術(shù)，他們在五個基因位點上實現(xiàn)了片段替換和原位的Flag標簽蛋白的精準融合，效率最高達到了11.4%。這一技術(shù)突破將非常有助于植物學(xué)研究，并大大促進農(nóng)作物定向遺傳改良的進程。