[所屬分類:技術(shù)資料] [發(fā)布時(shí)間:2023-10-10] [發(fā)布人:網(wǎng)站管理員] [閱讀次數(shù):] [返回]

口腔支原體（ATCC23714）和肺炎支原體（ATCC15531）的活化保種過(guò)程，通過(guò)學(xué)習(xí)和比較，總結(jié)了其中的一些注意事項(xiàng)；同時(shí)對(duì)中國(guó)藥典和歐美藥典在支原體培養(yǎng)上的一些差異進(jìn)行比較，來(lái)和大家分享一下，互相學(xué)習(xí)，共同進(jìn)步。

支原體活化和保種 

01 準(zhǔn)備

  這準(zhǔn)備，是指整個(gè)實(shí)驗(yàn)開(kāi)展前的學(xué)習(xí)準(zhǔn)備。

  因?yàn)?代的口腔支原體（ATCC 23714）和肺炎支原體（ATCC 15531）只能從ATCC購(gòu)買，如果是第一次購(gòu)買并嘗試活化凍干支原體，那么把ATCC關(guān)于這兩株菌的產(chǎn)品說(shuō)明、檢驗(yàn)報(bào)告、SDS等，甚至包括ATCC細(xì)菌學(xué)指南《ATCC Bacteriology_Guide》、2015版《中國(guó)藥典》三部 3301《支原體檢查法》、USP34 63《支原體檢查法》、EP8.0《2.6.7. MYCOPLASMAS》等資料通讀一遍是十分有必要的。

  甚至還可以下載幾本書(shū)，例如《支原體學(xué)》第2版、《支原體-醫(yī)學(xué)微生物學(xué)》、《支原體與支原體病》等了解下支原體的一些基本情況。

  在這一階段最好能確定好活化凍干支原體的具體操作方法，然后去按方法去操作。

比如說(shuō)：

  是采用中國(guó)藥典的支原體肉湯培養(yǎng)基和精氨酸支原體肉湯培養(yǎng)基，還是采用ATCC指定的ATCC 2611 培養(yǎng)基和ATCC 243培養(yǎng)基？

  是采用甘油保藏法、還是直接分裝法、還是凍干法進(jìn)行保種呢？

  在購(gòu)買前先制定好計(jì)劃，可以避免反復(fù)下單購(gòu)買培養(yǎng)基或試劑，省時(shí)省力，有效避免遺漏。

02 購(gòu)買

 

ATCC口腔支原體和肺炎支原體

  確定好了，就可以下單進(jìn)行購(gòu)買。

  為了讓大家更好的了解差異，本次比較，同時(shí)采用了中國(guó)藥典的配方培養(yǎng)基和ATCC指定的培養(yǎng)基進(jìn)行活化。

因?yàn)橹挥胁捎肁TCC的配方培養(yǎng)基，后續(xù)如果出問(wèn)題，ATCC才會(huì)承認(rèn)。但是ATCC的配方培養(yǎng)基成分比較復(fù)雜，一些成分要從國(guó)外采購(gòu)，耗時(shí)費(fèi)力，考慮到長(zhǎng)期使用的方便性，故中國(guó)藥典的培養(yǎng)基一并使用，兩家進(jìn)行比較，如果并無(wú)差別，后續(xù)就可直接采用中國(guó)藥典的培養(yǎng)基。

  建議初次活化的人，也同時(shí)使用兩家的培養(yǎng)基，以確認(rèn)中國(guó)藥典的培養(yǎng)基適用性，這樣后續(xù)就可以直接使用中國(guó)藥典的培養(yǎng)基。

  很不幸的是，在我們的這次比較當(dāng)中，中國(guó)藥典的相關(guān)培養(yǎng)基促支原體生長(zhǎng)的能力比ATCC的配方培養(yǎng)基要差。

ATCC和CP的支原體培養(yǎng)基配方比較

 

 

  可以看出，ATCC的相關(guān)培養(yǎng)基成分要更復(fù)雜，營(yíng)養(yǎng)成分更豐富的。并且EP、USP的支原體章節(jié)對(duì)培養(yǎng)基配方中腦心浸液等以液體形式加入培養(yǎng)基的混合性生物原材料的主要成分含量做了明確的規(guī)定。

  《中國(guó)藥典》支原體培養(yǎng)基配方中對(duì)以液體形式加入豬胃消化液和牛肉浸液，并未對(duì)兩者的配方和制法作出更明確的規(guī)定。（參見(jiàn)不同來(lái)源藥品支原體檢查用培養(yǎng)基的促生長(zhǎng)能力研究_趙宏大）。這就是造成國(guó)產(chǎn)商品化培養(yǎng)基質(zhì)量參差不齊的不確定因素。從世界范圍來(lái)講，《中國(guó)藥典》支原體培養(yǎng)基是屬于“小眾”產(chǎn)品。

  注意：如果采用ATCC的相關(guān)培養(yǎng)基，其中像酪蛋白胰蛋白酶消化液、明膠胰臟消化液、馬血清、10X CMRL 1066培養(yǎng)基、酵母提取物等配方中有些添加物是不對(duì)國(guó)內(nèi)出售的，要和ATCC咨詢替代產(chǎn)品，提早訂購(gòu)，免得耗時(shí)太久。
03 活化
根據(jù)ATCC的產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)，步驟總結(jié)如下：

a. 按照隨附說(shuō)明打開(kāi)小瓶。

b. 使用1ml移液器，移取0.5ml規(guī)定的肉湯培養(yǎng)基水化凍干粉。并混勻。

c.通過(guò)從原始管中轉(zhuǎn)移0.25mL至含有2.5mL的管進(jìn)行連續(xù)稀釋。稀釋是重要的，可保持支原體培養(yǎng)處于不同的生長(zhǎng)階段。一旦達(dá)到酸性或堿性條件，許多菌株將迅速消亡。 

d. 液體培養(yǎng)基在密閉容器內(nèi)培養(yǎng)，使用未接種的肉湯管作為陰性對(duì)照。

e. 可以接種平板以檢查菌落形態(tài)。在37℃ 5％CO2中生長(zhǎng)。固體培養(yǎng)基在微需養(yǎng)中培養(yǎng)，并保持充足濕度，防止瓊脂表面干燥。

f. 口腔支原體接種到液體培養(yǎng)基里，在48到72小時(shí)內(nèi)，在前幾個(gè)稀釋管中會(huì)出現(xiàn)中等到輕度的混濁。固體培養(yǎng)基上出現(xiàn)菌落需要更長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間。肺炎支原體菌株生長(zhǎng)更緩慢，并且產(chǎn)生非常輕的濁度。可根據(jù)顏色變化來(lái)決定何時(shí)終止培養(yǎng)。從紅色到橙色到黃色的指標(biāo)變化很容易識(shí)別。當(dāng)培養(yǎng)基為橙色時(shí)，支原體最好轉(zhuǎn)移傳代。變?yōu)辄S色后，支原體已經(jīng)開(kāi)始死亡。

 

肺炎支原體各個(gè)培養(yǎng)階段顏色變化

 

口腔支原體和肺炎支原體的菌落鏡檢圖

 

支原體煎蛋型菌落實(shí)物圖

 

支原體菌落結(jié)構(gòu)圖

 

  “支原體由于缺少細(xì)胞壁，所以在固體培養(yǎng)基上會(huì)形成特殊的“油煎蛋”狀，其中“蛋黃”部分是支原體向培養(yǎng)基內(nèi)部生長(zhǎng)的結(jié)果，“蛋清”部分是支原體在培養(yǎng)基表面生長(zhǎng)形成的。在同一視野下區(qū)分支原體、細(xì)胞殘?jiān)�、氣泡�?duì)檢定人員對(duì)支原體形態(tài)的辨識(shí)度要求較高，細(xì)胞殘?jiān)�在固體培養(yǎng)基上沒(méi)有均一的形態(tài)，邊緣不整齊。而氣泡在鏡下觀察則中心部分由于透光率高，鏡下觀察中心明亮，四周較暗。只有很好的區(qū)分出三者的區(qū)別才能在檢測(cè)中減少誤判、錯(cuò)判的概率。

  培養(yǎng)時(shí)間、培養(yǎng)基成分對(duì)支原體在固體培養(yǎng)上的形態(tài)也有一定影響。一般支原體在固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)2 ～ 3 天后才能在鏡下觀察到“油煎蛋”形態(tài)，且從第2 天起支原體向四周生長(zhǎng)的速度明顯加快，鏡下菌體大小變化明顯，7 天后菌體向四周生長(zhǎng)的速度減慢但仍向培養(yǎng)基內(nèi)部生長(zhǎng)，菌體顏色逐漸加深、變暗，邊緣由平滑變得粗糙不規(guī)整，菌體開(kāi)始老化�！�

——易致污染的支原體在固體培養(yǎng)基上的形態(tài)特征 傅元欣
04 保種
  保種方法有很多種，據(jù)說(shuō)液氮儲(chǔ)存是最好的方法，不過(guò)條件受限。一般，也可采用直接分裝保存含支原體的培養(yǎng)基；在-20℃下保存，一般保存期限為1-3年；10%甘油保存法，在-80℃冷凍下，支原體可保存約4年；支原體凍干保存，在2-8℃下，可無(wú)期限保存。建議采用10%甘油保存法，有條件的采用凍干法。

  10%甘油保存法：支原體生長(zhǎng)后，將處于含對(duì)數(shù)期的支原體的培養(yǎng)基高速離心收集，肺炎支原體建議9000rpm離心30分鐘，口腔支原體自己評(píng)估。倒去上清液，再懸浮于適量相應(yīng)的新鮮肉湯培養(yǎng)基中。加入等量的20%甘油，甘油終濃度為10%。20%甘油可以高溫滅菌，也可過(guò)濾除菌。

  凍干法：支原體生長(zhǎng)后，將處于含對(duì)數(shù)期的支原體的培養(yǎng)基高速離心收集，倒去上清液，再懸浮于適量相應(yīng)的新鮮肉湯培養(yǎng)基中。加入等量的ATCC培養(yǎng)基9520（ATCC培養(yǎng)基9520為10％BSA和20％蔗糖的混合物，過(guò)濾除菌既得）中懸浮并徹底混合。取適量懸浮液分配到每個(gè)安瓿瓶中。放入凍干機(jī)內(nèi)進(jìn)行凍干。凍干程序可參考《ATCC細(xì)菌學(xué)指南》相關(guān)規(guī)定。

支原體凍干粉

中國(guó)藥典和歐美藥典差異

  通過(guò)對(duì)比可以看出，中國(guó)藥典在支原體培養(yǎng)法中和歐美藥典的差異、甚至可以說(shuō)是不足，這是十分值得思考和總結(jié)的。

例如：

①CP所用培養(yǎng)基促支原體生長(zhǎng)能力偏弱；

②CP沒(méi)有規(guī)定支原體的培養(yǎng)條件中需氧量；

③CP沒(méi)有限定支原體的傳代次數(shù)；

④CP在支原體檢查第一法中，并沒(méi)有要求同步做陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照；

⑤CP僅憑肉湯顏色變化，便判斷有無(wú)支原體并不夠嚴(yán)謹(jǐn)，顏色的變化是有多種可能原因的，有可能是微生物污染，導(dǎo)致培養(yǎng)基pH變化，導(dǎo)致酚紅指示劑顏色的變化。在判標(biāo)上，歐美都要求將肉湯再次接種到平板上通過(guò)菌落判斷。

  中美藥典的這些差異，給企業(yè)在實(shí)際操作過(guò)程中帶來(lái)了不小的困惑和不確定性。因此，建議下一版《中國(guó)藥典》在修訂時(shí)，將培養(yǎng)條件、液體培養(yǎng)基及固體培養(yǎng)基具體的培養(yǎng)方法以及增加觀察菌落來(lái)判斷等內(nèi)容都能進(jìn)一步明確，減少企業(yè)在實(shí)際操作過(guò)程中的困惑。

參考資料

1、ATCC23714口腔支原體和ATCC15531肺炎支原體產(chǎn)品說(shuō)明、檢驗(yàn)報(bào)告

2、ATCC細(xì)菌學(xué)指南《ATCC Bacteriology_Guide》

3、2015《中國(guó)藥典》三部3301 支原體檢查法

4、USP 《63支原體檢查法》、

5、EP《2.6.7. MYCOPLASMAS》

6、《支原體學(xué)》第2版

7、《支原體-醫(yī)學(xué)微生物學(xué)》

8、《支原體與支原體病》

9、淺談國(guó)內(nèi)支原體培養(yǎng)和鑒定中存在的問(wèn)題_趙旺勝

10、支原體檢查試驗(yàn)培養(yǎng)條件考察_趙宏大

11、易致污染的支原體在固體培養(yǎng)基上的形態(tài)特征_傅元欣-

12、中國(guó)藥典與歐美藥典對(duì)支原體檢查培養(yǎng)基規(guī)定的差異