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中 華 人 民 共 和 國 國 家 標 準
GB 5413.15—2010
中 華 人 民 共 和 國 衛(wèi) 生 部 發(fā)布
2010-03-26 發(fā)布 2010-06-01 實施
食品安全國家標準
嬰幼兒食品和乳品中煙酸和煙酰胺的測定
National food safety standard
Determination of vitamin niacin and niacinamide in foods for infants and
young children,milk and milk products

GB 5413.15—2010
I
前 言
本標準第二法等同采用國際分析家學會（AOAC） 944.13 Niacin and Niacinamide(Nicotinic Acid and
Nicotinamide) in Vitamin Preparations。
本標準代替GB/T 5413.15-1997《嬰幼兒配方食品和乳粉 煙酸和煙酰胺的測定》。
本標準第二法與GB/T 5413.15-1997相比，主要變化如下：
——增加了光密度法測定；
——增加了淀粉類試樣的測定；
——增加標準曲線繪制的文字描述。
本標準附錄 A 為資料性附錄。
本標準代替標準的歷次版本發(fā)布情況為：
——GB 5413-1985、 GB/T 5413.15-1997。

GB 5413.15—2010
1
食品安全國家標準
嬰幼兒食品和乳品中煙酸和煙酰胺的測定
1 范圍
本標準規(guī)定了嬰幼兒食品和乳品中煙酸和煙酰胺的測定方法。
本標準適用于嬰幼兒食品和乳品中煙酸和煙酰胺的測定。
2 規(guī)范性引用性文件
本標準中引用的文件對于本標準的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本
適用于本標準。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本標準。
第一法 高效液相色譜法
3 原理
試樣經(jīng)熱水提取、酸性沉淀蛋白質(zhì)后，以 C18 色譜柱分離，用紫外檢測器定量。
4 試劑和材料
除非另有規(guī)定，本方法所用試劑均為分析純，水為GB/T 6682規(guī)定的一級水。
4.1 淀粉酶：酶活力≥1.5 U/mg。
4.2 鹽酸。
4.3 氫氧化鈉。
4.4 鹽酸(2.4 mol/L)：準確移取 10 mL 鹽酸（4.2）于 50 mL 容量瓶中，用水定容。
4.5 氫氧化鈉溶液（2.5 mol/L）：稱取 5.0g 氫氧化鈉（4.3）于 50 mL 容量瓶中，用水定容。
4.6 高氯酸（HClO4）：體積分數(shù)為 60%。
4.7 甲醇（CH4O）：色譜純。
4.8 異丙醇(C3H8O)：色譜純。
4.9 庚烷磺酸鈉(C7H15NaO3S)：優(yōu)級純。
4.10 標準溶液
4.10.1 煙酸及煙酰胺標準儲備液（1.0 mg/mL） ： 稱取煙酸及煙酰胺標準品各 0.1 g（精確到 0.0001 g） ，
分別置于 100 mL 容量瓶中，用水溶解定容。
4.10.2 煙酸及煙酰胺混合標準中間液（40 μg/mL）：分別準確吸取煙酸及煙酰胺標準儲備液（4.10.1）
2 mL 至 50 mL 定量瓶中，用水定容。臨用前配制。

GB 5413.15—2010
2
4.10.3 煙酸及煙酰胺混合標準系列測定液： 分別準確吸取煙酸及煙酰胺混合標準中間液（4.10.2） 0.0
mL、1.0 mL、2.0 mL、5.0 mL、10.0 mL， 至 50 mL 容量瓶中用水定容。該標準系列濃度分別為 0.00 μg/mL、
0.80 μg/mL、 1.60 μg/mL、 4.00 μg/mL、 8.00 μg/mL。臨用前配制。
5 儀器和設(shè)備
5.1 高效液相色譜儀，帶紫外檢測器。
5.2 pH 計：精度為 0.01。
5.3 超聲波振蕩器。
5.4 天平：感量為 0.1 mg。
5.5 培養(yǎng)箱： 30 ℃ ～80 ℃ 。
6 分析步驟
6.1 試樣的預(yù)處理
6.1.1 含淀粉的試樣：稱取混合均勻固體試樣約 5.0 g（精確到 0.0001 g）加入約 25 mL 45 ℃～50 ℃
的水，或稱取混合均勻液體試樣約 20.0 g（精確到 0.0001 g）于 150 mL 錐形瓶中，再加入約 0.5 g 淀粉
酶（4.1），搖勻后向錐形瓶中充氮，蓋上瓶塞，置于 50 ℃～60 ℃的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)約 30 min，取出冷
卻至室溫。
6.1.2 不含淀粉的試樣：稱取混合均勻固體試樣約 5.0 g（精確到 0.0001 g）加入約 25 mL 45 ℃～50 ℃
的水，或稱取混合均勻液體試樣約 20.0 g（精確到 0.0001 g）于 150 mL 錐形瓶中，振搖，靜置 5 min～
10 min，充分溶解，并冷卻至室溫。
6.1.3 提�。簩⑸鲜鲥F形瓶置于超聲波振蕩器中振蕩約 10 min。
6.1.4 沉淀及定容：待試樣溶液降至室溫后，用鹽酸（4.4）調(diào)節(jié)試樣溶液的 pH 值至 1.7 ±0.1，放置約
2 min 后，再用氫氧化鈉溶液（4.5）調(diào)節(jié)試樣溶液的 pH 值至 4.5 ±0.1。將試樣溶液轉(zhuǎn)至 50 mL 容量瓶
中，用水反復(fù)沖洗錐形瓶，洗液合并于 50 mL 容量瓶中，用水定容至刻度，混勻后經(jīng)濾紙過濾，濾液
再經(jīng) 0.45 μm 微孔濾膜加壓過濾，用試管收集，即為試樣待測液。
6.2 參考色譜條件
色譜柱： C18 柱（粒徑5 μm， 150 mm ×4.6 mm）或具有同等性能的色譜柱。
流動相：甲醇（4.7） 70 mL，異丙醇（4.8） 20 mL，庚烷磺酸鈉（4.9） 1 g，用910 mL水溶解并混
勻后，用高氯酸（4.6）調(diào)pH至2.1 ± 0.1，經(jīng)0.45 μm膜過濾。
流速： 1.0 mL/min。
檢測波長： 261 nm。
柱溫： 25 ℃ 。
進樣量： 10 μL。
6.3 定量分析
6.3.1 標準曲線繪制
將煙酸及煙酰胺混合標準系列測定液（4.10.3）依次進行色譜測定（其標準樣品色譜圖參見附錄 A
中圖 A.1.1）。記錄各組分的色譜峰面積或峰高，以峰面積或峰高為縱坐標，以標準測定液的濃度為橫
坐標，繪制標準曲線。

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3
6.3.2 試樣測定
將試樣待測液（6.1.4）進行色譜測定。記錄各組分色譜峰面積或峰高，根據(jù)標準曲線計算出試樣待
測液中煙酸及煙酰胺各組分的濃度 c
i
。
7 分析結(jié)果的表述
7.1 試樣中煙酸或煙酰胺含量的計算
試樣中煙酸或煙酰胺的含量按（1）式計算：
Vm
c
X i 100
1 2
× ×
或 = ………………………………………………………………（1）
式中：
X1 或 2——試樣中煙酸或煙酰胺的含量，單位為微克每百克（μg/100 g）；
m——試樣的質(zhì)量，單位為克（g）；
c
i
——試樣待測液中煙酸或煙酰胺的濃度，單位為微克每毫升（μg/mL）；
V——試樣溶液的體積，單位為毫升（mL）。
7.2 試樣中維生素煙酸總含量的計算
試樣中維生素煙酸的總含量按（2）式計算：
X ＝
X1 2 + X ……………………………………………………………………………（2）
式中：
X——試樣中維生素煙酸的總含量，單位為微克每百克（μg/100 g）；
X1——試樣中煙酸的含量，單位為微克每百克（μg/100 g）；
X2——試樣中煙酰胺的含量，單位為微克每百克（μg/100 g）。
以重復(fù)性條件下獲得的兩次獨立測定結(jié)果的算術(shù)平均值表示，結(jié)果保留兩位有效數(shù)字。
8 精密度
在重復(fù)性條件下獲得的兩次獨立測定結(jié)果的絕對差值不得超過算術(shù)平均值的10 %。
第二法 微生物法
9 原理
利用植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum） ATCC 8014 對煙酸和煙酰胺的特異性，在含有煙酸和煙
酰胺的樣品中生長產(chǎn)生的酸度和形成的光密度來測定煙酸和煙酰胺的含量。
10 試劑和材料
除非另有規(guī)定，本方法所用試劑均為分析純，水為 GB/T 6682 規(guī)定的二級水。
10.1 硫酸溶液 A（10 mol/L）：將質(zhì)量分數(shù)為 95 %～98 %的濃硫酸 560 mL 緩慢加入到 600 mL 水中，
邊加邊攪拌，冷卻后定容至 1000 mL。

GB 5413.15—2010
4
10.2 硫酸溶液 B（1 mol/L）：吸取 100 mL 10 mol/L 的硫酸溶液 A（10.1），轉(zhuǎn)移至 1000 mL 容量瓶
用水定容。
10.3 氫氧化鈉溶液 A（3.75 mol/L）：稱取 150 g 氫氧化鈉于 1000 mL 燒杯中，用 400 mL 水溶解，冷
卻至室溫后，轉(zhuǎn)移至 1000 mL 容量瓶中，用水定容。
10.4 氫氧化鈉溶液 B（0.375 mol/L）：吸取 100 mL 氫氧化鈉溶液 A（10.3）轉(zhuǎn)移至 1000 mL 容量瓶
用水定容。
10.5 氫氧化鈉標準滴定溶液（0.1 mol/L ± 0.0002 mol/L）：稱取 4g（精確至 0.0001 g）氫氧化鈉用水
稀釋至 1000 mL，用鄰苯二甲酸氫鉀標定。保存此溶液的容器要密封，以防二氧化碳滲透。
10.5.1 氫氧化鈉標準溶液的標定：稱取約 0.18 g（精確至 0.0001 g）于 105 ℃ ～110 ℃ 烘至恒重的鄰
苯二甲酸氫鉀，用 50 mL 除二氧化碳的水溶于錐形瓶中，加兩滴 5 g/L 的酚酞指示劑，用配好的氫氧化
鈉溶液滴定至粉紅色，同時作空白實驗。氫氧化鈉標準溶液的濃度為：
c=
( ) 0.2042
m
V1 -V2 ×
……………………………………………………………(3)
式中：
c——氫氧化鈉的濃度，單位為摩爾每升（mol/L）；
m——鄰苯二甲酸氫鉀的質(zhì)量，單位為克（g）；
V1——氫氧化鈉溶液的用量，單位為毫升（mL）；
V2——空白試驗氫氧化鈉溶液的用量，單位為毫升（mL）。
10.5.2 酚酞溶液：稱取 0.5 g 酚酞溶于 75 mL 體積分數(shù)為 95 %的乙醇中，并加入 20mL 水，加入氫氧
化鈉標準滴定溶液（10.5），直至加入一滴立即變成粉紅色，再加入水定容至 100 mL。
10.6 鹽酸（0.1 mol/L）：吸取 8.3 mL 鹽酸，用水稀釋至 1000 mL。
10.7 乙醇溶液：體積分數(shù)為 25 %。量取 250 mL 無水乙醇，加入 750 mL 水，混勻。
10.8 菌株：植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum） ATCC 8014。
10.9 培養(yǎng)基（或可使用商品化的合成培養(yǎng)基）
10.9.1 乳酸桿菌瓊脂培養(yǎng)基：光解胨 15 g，葡萄糖 10 g，番茄汁 100 mL，磷酸二氫鉀 2 g，聚山梨糖
單油酸酯 1 g，瓊脂 10 g，加蒸餾水至 1000 mL， pH6.8 ± 0.2（20 ℃ ～25 ℃ ）。 121℃ 高壓滅菌 15min，
備用。
10.9.2 乳酸桿菌肉湯培養(yǎng)基：光解胨 15g，葡萄糖 10 g，番茄汁 100 mL，磷酸二氫鉀 2 g，聚山梨糖
單油酸酯 1 g，加蒸餾水至 1000 mL， pH 6.8 ± 0.2（20 ℃ ～25 ℃ ）。 121℃ 高壓滅菌 15min，備用。
10.9.3 煙酸測定用培養(yǎng)基：維生素測定用酸水解酪蛋白氨基酸（Casamino Acids） 12 g，葡萄糖 40 g，
乙酸鈉 20 g， L-胱氨酸 0.4 g， DL-色氨酸 0.2 g，鹽酸腺嘌呤 20 mg，鹽酸鳥嘌呤 20 mg，尿嘧啶 20 mg，
鹽酸硫胺素 200 μg，泛酸鈣 200 μg，鹽酸吡哆醇 400 μg，核黃素 400 μg， p-氨基苯甲酸 100 μg，生物素
0.8 μg，磷酸氫二鉀 1 g，磷酸二氫鉀 1 g，硫酸鎂 0.4 g，氯化鈉 20 mg，硫酸亞鐵 20 mg，硫酸錳 20 mg。
加蒸餾水至 1000 mL，調(diào) pH 至 6.7 ± 0.2（20 ℃ ～25 ℃ ）。
10.10 標準溶液

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10.10.1 煙酸標準貯備液（100 μg/mL）： 在五氧化二磷干燥器中取出已干燥的煙酸標準品，稱取 50.0
mg (精確至 0.1 mg)，用乙醇溶液（10.7）溶解并定容至 500 mL， 2 ℃～4 ℃冰箱冷藏，保存期為 4 個
月。
10.10.2 煙酸標準中間溶液（10 μg/mL）：從煙酸標準貯備液（10.10.1）中吸取 10 mL 至 100 mL 容
量瓶，用乙醇溶液（10.7）定容， 2 ℃～4 ℃冰箱冷藏，保存期為 1 個月。
10.10.3 煙酸標準工作液（100 ng/mL）：從標準中間液（10.10.2）中吸取 5.0 mL，用水稀釋至 500 mL。
臨用前配制。
10.11 0.9 %生理鹽水：稱 0.9 g 氯化鈉于 100 mL 容量瓶中，稀釋至刻度，振蕩溶解。分裝于具塞試管
中，每管 10 mL， 121 ℃ 滅菌 15 min，每周準備一次。
10.12 溴麝香草酚藍指示劑：稱取 0.1 g 溴麝香草酚藍于研缽中，加入 1.6 mL 氫氧化鈉標準滴定溶液
（10.5）研磨，加少許水至完全溶解，轉(zhuǎn)移至 250 mL 容量瓶中用水定容。
11 儀器和設(shè)備
11.1 分光光度儀。
11.2 pH 計：精度為 0.01。
11.3 渦旋振蕩器。
11.4 天平：感量為 0.1 mg。
11.5 生化培養(yǎng)箱： 36 ℃ ±1 ℃ 。
11.6 離心機：轉(zhuǎn)速≥2000 轉(zhuǎn)/分鐘。
11.7 滴定管：分刻度值為 0.1 mL。
12 分析步驟
12.1 測試菌液的制備
12.1.1 把植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）ATCC 8014 凍干菌粉轉(zhuǎn)入乳酸桿菌肉湯培養(yǎng)基（10.9.2）
試管中， 36 ℃ ± 1℃ 培養(yǎng) 24 h，轉(zhuǎn)接至乳酸桿菌瓊脂培養(yǎng)基（10.9.1）試管中， 36 ℃ ± 1 ℃ 再培養(yǎng) 24 h。
培養(yǎng)好的乳酸桿菌瓊脂培養(yǎng)基（10.9.1）試管的培養(yǎng)物作為貯備菌種。
12.1.2 從貯備菌種培養(yǎng)基上分別轉(zhuǎn)接到三個乳酸桿菌瓊脂培養(yǎng)基（10.9.1）試管中，放入培養(yǎng)箱中 36
℃ ± 1 ℃ 培養(yǎng) 24 h。每月轉(zhuǎn)接一次，作為月接種管貯于冰箱中。每月定期從月接種管中重新接種 3 個轉(zhuǎn)
接管保存新菌株。
12.1.3 從月接種的培養(yǎng)管中的一支再接種一支乳酸桿菌瓊脂培養(yǎng)基（10.9.1）試管， 36 ℃ ±1 ℃ 培養(yǎng)
24 h，作為日接種管每日測定用。
12.1.4 從日接種管中接種一管乳酸桿菌肉湯培養(yǎng)基（10.9.2）， 36 ℃ ± 1 ℃ 培養(yǎng) 24 h。在無菌條件下
離心該培養(yǎng)液 10 min（2000 轉(zhuǎn)/分鐘），棄去上清液。用 10 mL 生理鹽水（10.11）振蕩洗滌菌體，離心
10 min（2000 轉(zhuǎn)/分鐘），棄去上清液，再加入 10 mL 生理鹽水（10.11）振蕩清洗。如前離心操作，棄
去上清液。再加 10 mL 生理鹽水（10.11），混勻。吸取適量該菌懸液于 10 mL 生理鹽水（10.11）中，
混勻制成測試菌液。
12.1.5 以生理鹽水（10.11）做對照，用分光光度計于 550 nm 波長下，測測試菌液（12.1.4）的透光
率，此值應(yīng)在 60 %～80 %之間。

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12.2 試樣的制備
稱取 2 g（精確至 0.0001 g）固態(tài)試樣或 5 g（精確至 0.0001 g）液態(tài)試樣（約含煙酸 0.1 mg）于 250
mL 三角燒瓶中，加 20 mL 的硫酸溶液 B（10.2）溶解試樣，放入高壓滅菌釜中 121 ℃ 保持 30 min，取
出冷卻至室溫。 用氫氧化鈉溶液 A（10.3）和氫氧化鈉溶液 B（10.4）調(diào) pH 至 6.0～6.5， 再用鹽酸（10.6），
調(diào) pH 至 4.5 ± 0.1，用水定容至 100 mL，過濾。吸取 25 mL 濾液于 100 mL 燒杯中，用氫氧化鈉標準滴
定溶液（10.5）調(diào) pH 至 6.8 ± 0.1，轉(zhuǎn)入 250 mL 容量瓶中定容。
12.3 標準曲線管的制作
按表 1 順序加入蒸餾水、標準溶液和培養(yǎng)基于試管中，表 1 中每一編號需制作 3 管。試管 S2 至 S7
中，相當煙酸含量為 0 ng、 100 ng、 200 ng、 300 ng、 400 ng、 500 ng。
表 1 標準曲線管的制作

試管號	S1	S2	S3	S4	S5	S6	S7
蒸餾水（mL）	5	5	4	3	2	1	0
標準溶液（mL）	0	0	1	2	3	4	5
培養(yǎng)基（mL）	5	5	5	5	5	5	5

12.4 試樣管的制作
按表 2 順序加入蒸餾水、試樣和培養(yǎng)基于試管中，表中每一編號需制作 3 管。
表 2 試樣管的制作

試管號	1	2	3	4
蒸餾水（mL）	4	3	2	1
樣 品（mL）	1	2	3	4
培養(yǎng)基（mL）	5	5	5	5

12.5 滅菌
將標準曲線管和試樣管 121 ℃ 滅菌 5 min，迅速冷卻到室溫（商品化培養(yǎng)基按標簽說明進行滅菌)。
注： 保證加熱和冷卻過程中條件均勻，滅菌管數(shù)過多或距離太近，在滅菌鍋中都可產(chǎn)生不良影響。
12.6 接種
在無菌條件下，向上述每管中各加入一滴（約 50 μL）測試菌液（12.1.4），加蓋，充分振蕩混勻所
有試管（標準曲線未接種空白管 S1 除外）。
12.7 培養(yǎng)
12.7.1 酸度法：在 36 ℃ ± 1 ℃ ，培養(yǎng) 72 h。通過對每個試管的目測檢查，未接種試管內(nèi)培養(yǎng)液應(yīng)是
澄清的，標準曲線管和試樣管中培養(yǎng)液的濁度應(yīng)有梯度。未接種管若混濁，則測定無效。
12.7.2 光密度法：在 36 ℃ ± 1 ℃ ，培養(yǎng) 16 h～24 h。其他同 12.7.1。
12.8 測定
12.8.1 酸度法
12.8.1.1 用 10 mL 水將未接種空白管 S1 和接種空白管 S2 的培養(yǎng)物轉(zhuǎn)至三角燒瓶中，以溴麝香草酚
藍（10.12）作指示劑，或用 pH 計以 pH 6.8 ± 0.2 為滴定終點用氫氧化鈉標準滴定溶液（10.5）滴定標
準曲線管中未接種空白管 S 1 和接種空白管 S 2。記錄下消耗的氫氧化鈉標準滴定溶液體積。

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注： 如果接種空白滴定反應(yīng)消耗的氫氧化鈉標準滴定溶液體積數(shù)等于或高于未接種空白水平的1.5 mL，則測定結(jié)果
無效。
12.8.1.2 用 10 mL 水將標準曲線管和試樣管中的培養(yǎng)物轉(zhuǎn)至三角燒瓶中，以溴麝香草酚藍（10.12）
作指示劑，或用 pH 計以 pH 6.8 ± 0.2 為滴定終點用氫氧化鈉標準滴定溶液（10.5）滴定標準曲線管和試
樣管的培養(yǎng)物。記錄下消耗的氫氧化鈉標準滴定溶液體積。
注： 通常標準曲線管 S7 消耗的氫氧化鈉標準滴定溶液體積數(shù)在 8 mL～12 mL 之間。
12.8.2 光密度法
以接種空白管（表 1 中試管號 S 2） 作對照， 取出最高濃度標準曲線管 S 7， 振蕩 5 s， 在波長 550 nm
條件下讀取光密度值，放回重新培養(yǎng)。 2 h 后同等條件重新測該管的光密度，如果兩次光密度的絕對差
結(jié)果≤2 %，則取出全部檢驗管測定標準溶液和試樣的光密度。
12.9 標準曲線的繪制
以標準曲線管煙酸含量作橫坐標， 以消耗氫氧化鈉標準滴定溶液的滴定毫升數(shù)或光密度值為縱坐標
繪制標準曲線。
12.10 試樣管中煙酸含量的計算
按照 12.8 每個試樣管測定消耗的氫氧化鈉標準滴定溶液的毫升數(shù)或光密度值，從標準曲線中查得
對應(yīng)的煙酸含量。每一編號的三個試樣管應(yīng)計算管中每毫升測定液煙酸的含量，并與其平均值相比較。
相對偏差小于 15 %的試管為有效試管，無效試樣管應(yīng)舍去，有效試樣管總數(shù)應(yīng)大于所有試樣管總數(shù)的
2/3。重新計算每一編號的有效試樣管中每毫升測定液煙酸含量的平均值，以此平均值計算全部編號試
樣管的總平均值 Cx。
注： 樣品管中煙酸含量低于 100 ng，高于 500 ng 的值應(yīng)舍去。
13 分析結(jié)果的表述
試樣中煙酸（煙酰胺）含量按式（4）計算：
X= 100
1000
× ×
f
Cxm
…………………………………………………………………（4）
式中：
X——試樣中煙酸（煙酰胺）含量，單位為微克每百克（μg/100 g）；
Cx—— 12.10 中計算所得的總平均值，單位為納克（ng）；
f——稀釋倍數(shù)；
m——試樣的質(zhì)量或體積，單位為克（g）。
以重復(fù)性條件下獲得的兩次獨立測定結(jié)果的算術(shù)平均值表示，結(jié)果保留兩位有效數(shù)字。
14 精密度
在重復(fù)性條件下獲得的兩次獨立測定結(jié)果的絕對差值不得超過算術(shù)平均值的 10 %。
15 其他
本標準第一法檢出限為：煙酸30 μg/100 g，煙酰胺40 μg/100 g。

GB 5413.15—2010
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附錄 A
（資料性附錄）
煙酸和煙酰胺標準溶液的液相色譜圖
A.1 煙酸和煙酰胺標準溶液的液相色譜圖
煙酸和煙酰胺標準溶液的液相色譜圖見圖 A.1。
圖 A.1 煙酸和煙酰胺標準溶液的液相色譜