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中華人民共和國國家標準
GB 4789.13—2012
食品安全國家標準
食品微生物學檢驗 產氣莢膜梭菌檢驗
中 華 人 民 共 和 國 衛(wèi) 生 部
發(fā)布
2012-05-17 發(fā)布  2012-07-17 實施
GB 4789.13—2012
I
前 言
本標準代替 GB/T 4789.13—2003《食品衛(wèi)生微生物學檢驗 產氣莢膜梭菌檢驗》。
本標準與GB/T 4789.13—2003 相比，主要變化如下：
——修改了標準的中文名稱；
——修改了樣品制備過程；
——修改了培養(yǎng)基與試劑；
——修改了操作步驟；
——修改了菌數(shù)計算部分；
——增加了附錄A。
GB 4789.13—2012
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食品安全國家標準
食品微生物學檢驗 產氣莢膜梭菌檢驗
1 范圍
本標準規(guī)定了食品中產氣莢膜梭菌（Clostridium perfringens）的檢驗方法。
本標準適用于食品中產氣莢膜梭菌的檢驗。
2 設備和材料
除微生物實驗室常規(guī)滅菌及培養(yǎng)設備外，其他設備和材料如下：
a） 恒溫培養(yǎng)箱：36 ℃±1 ℃；
b） 冰箱：2 ℃～5℃；
c） 恒溫水浴箱：50℃±1 ℃，46℃±0.5℃；
d） 天平：感量 0.1 g；
e） 均質器；
f） 顯微鏡：10×～100×；
g） 無菌吸管：1 mL（具 0.01 mL 刻度）、10 mL（具 0.1 mL 刻度）或微量移液器及吸頭；
h） 無菌試管：18mm×180mm；
i） 無菌培養(yǎng)皿：直徑 90 mm；
j） pH 計或 pH 比色管或精密 pH 試紙；
k） 厭氧培養(yǎng)裝置。
3 培養(yǎng)基和試劑
3.1 胰胨-亞硫酸鹽-環(huán)絲氨酸（TSC）瓊脂：見附錄 A 中 A.1。
3.2 液體硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基（FTG）：見附錄 A 中 A.2。
3.3 緩沖動力-硝酸鹽培養(yǎng)基：見附錄 A 中 A.3。
3.4 乳糖-明膠培養(yǎng)基：見附錄 A 中 A.4。
3.5 含鐵牛乳培養(yǎng)基：見附錄 A 中 A.5。
3.6 0.1%蛋白胨水：見附錄 A 中 A.6。
3.7 革蘭氏染色液：見附錄 A 中 A.7。
3.8 硝酸鹽還原試劑：見附錄 A 中 A.8。
3.9 緩沖甘油-氯化鈉溶液：見附錄 A 中 A.9。
4 檢驗程序
GB 4789.13—2012
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產氣莢膜梭菌檢驗程序見圖 1。
圖 1 產氣莢膜梭菌檢驗程序
5 操作步驟
5.1 樣品制備
5.1.1 樣品采集后應盡快檢驗，若不能及時檢驗，可在 2 ℃～5 ℃保存；如 8 h 內不能進行檢驗，應以
無菌操作稱取 25 g（mL）樣品加入等量緩沖甘油-氯化鈉溶液（液體樣品應加雙料），并盡快至于-60 ℃
低溫冰箱中冷凍保存或加干冰保存。
5.1.2 以無菌操作稱取 25 g（mL）樣品放入含有 225 mL 0.1%蛋白胨水（如為 5.1.1 中冷凍保存樣品，
室溫解凍后，加入 200 mL 0.1%蛋白胨水）的均質袋中，在拍擊式均質器上連續(xù)均質 1 min～2 min；或
置于盛有 225 mL0.1%蛋白胨水的均質杯中，8 000 r/min～10 000 r/min 均質 1min～2 min，作為 1:10 稀釋
液。
5.1.3 以上述 1:10 稀釋液按 1 mL 加 0.1%蛋白胨水 9 mL 制備 10 -2 ～10 -6 的系列稀釋液。
檢 樣
25g(mL)檢樣+225 mL0.1%蛋白胨水
均質、稀釋
10 -1 ～10 -6 稀釋液各 1mL + TSC 瓊脂混合
厭氧培養(yǎng)，36℃±1℃、20h～24h，黑色菌落計數(shù)
任選黑色菌落 5 個，分別接種 FTG 培養(yǎng)基
確證試驗
鏡檢形態(tài)
乳糖-明膠
動力-硝酸鹽  牛奶發(fā)酵
報告
GB 4789.13—2012
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5.2 培養(yǎng)
5.2.1 吸取各稀釋液 1 mL 加入無菌平皿內，每個稀釋度做兩個平行。每個平皿傾注冷卻至 50 ℃的 TSC
瓊脂（可放置于 50 ℃±1 ℃恒溫水浴箱中保溫）15 mL，緩慢旋轉平皿，使稀釋液和瓊脂充分混勻。
5.2.2 上述瓊脂平板凝固后，再加 10 mL 冷卻至 50 ℃的 TSC 瓊脂（可放置于 50 ℃±1 ℃恒溫水浴箱
中保溫）均勻覆蓋平板表層。
5.2.3 待瓊脂凝固后，正置于厭氧培養(yǎng)裝置內，36 ℃±1 ℃培養(yǎng) 20 h～24 h。
5.2.4 典型的產氣莢膜梭菌在 TSC 瓊脂平板上為黑色菌落。
5.3 確證試驗
5.3.1 從單個平板上任選 5 個（小于 5 個全選）黑色菌落，分別接種到 FTG 培養(yǎng)基，36 ℃±1 ℃培養(yǎng)
18 h～24 h。
5.3.2 用上述培養(yǎng)液涂片，革蘭氏染色鏡檢并觀察其純度。產氣莢膜梭菌為革蘭氏陽性粗短的桿菌，有
時可見芽孢體。如果培養(yǎng)液不純，應劃線接種 TSC 瓊脂平板進行分純，36 ℃±1 ℃厭氧培養(yǎng) 20 h～24 h，
挑取單個典型黑色菌落接種到 FTG 培養(yǎng)基，36 ℃±1 ℃培養(yǎng) 18 h～24 h，用于后續(xù)的確證試驗。
5.3.3 取生長旺盛的 FTG 培養(yǎng)液 1 mL 接種于含鐵牛乳培養(yǎng)基，在 46 ℃±0.5 ℃水浴中培養(yǎng) 2 h 后，每
小時觀察一次有無“暴烈發(fā)酵”現(xiàn)象，該現(xiàn)象的特點是乳凝結物破碎后快速形成海綿樣物質，通常會上
升到培養(yǎng)基表面。5 h 內不發(fā)酵者為陰性。產氣莢膜梭菌發(fā)酵乳糖，凝固酪蛋白并大量產氣，呈“暴烈發(fā)
酵”現(xiàn)象，但培養(yǎng)基不變黑。
5.3.4 用接種環(huán)（針）取 FTG 培養(yǎng)液穿刺接種緩沖動力-硝酸鹽培養(yǎng)基，于 36 ℃±1 ℃培養(yǎng) 24 h。在透
射光下檢查細菌沿穿刺線的生長情況，判定有無動力。有動力的菌株沿穿刺線呈擴散生長，無動力的菌
株只沿穿刺線生長。然后滴加 0.5 mL 試劑甲和 0.2 mL 試劑乙以檢查亞硝酸鹽的存在。15 min 內出現(xiàn)紅
色者，表明硝酸鹽被還原為亞硝酸鹽；如果不出現(xiàn)顏色變化，則加少許鋅粉，放置 10 min，出現(xiàn)紅色者，
表明該菌株不能還原硝酸鹽。產氣莢膜梭菌無動力，能將硝酸鹽還原為亞硝酸鹽。
5.3.5 用接種環(huán)（針）取 FTG 培養(yǎng)液穿刺接種乳糖-明膠培養(yǎng)基，于 36 ℃±1 ℃培養(yǎng) 24 h，觀察結果。
如發(fā)現(xiàn)產氣和培養(yǎng)基由紅變黃，表明乳糖被發(fā)酵并產酸。將試管于 5 ℃左右放置 1 h，檢查明膠液化情況。
如果培養(yǎng)基是固態(tài)，于 36 ℃±1 ℃再培養(yǎng) 24 h，重復檢查明膠是否液化。產氣莢膜梭菌能發(fā)酵乳糖，使
明膠液化。
6 結果與報告
6.1 典型菌落計數(shù)
選取典型菌落數(shù)在 20 CFU～200 CFU 之間的平板，計數(shù)典型菌落數(shù)。如果：
a) 只有一個稀釋度平板的典型菌落數(shù)在 20CFU～200CFU 之間，計數(shù)該稀釋度平板上的典型菌落；
b）最低稀釋度平板的典型菌落數(shù)均小于 20 CFU，計數(shù)該稀釋度平板上的典型菌落；
c）某一稀釋度平板的典型菌落數(shù)均大于 200 CFU，但下一稀釋度平板上沒有典型菌落，應計數(shù)該稀
釋度平板上的典型菌落；
d）某一稀釋度平板的典型菌落數(shù)均大于 200 CFU，且下一稀釋度平板上有典型菌落，但其平板上的
典型菌落數(shù)不在 20 CFU～200 CFU 之間，應計數(shù)該稀釋度平板上的典型菌落；
e）2 個連續(xù)稀釋度平板的典型菌落數(shù)均在 20CFU～200CFU 之間，分別計數(shù) 2 個稀釋度平板上的典
型菌落。
6.2 結果計算
6.1 計數(shù)結果按公式（1）計算：
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……………………………………………… (1)
式中：
T——樣品中產氣莢膜梭菌的菌落數(shù)；
A——單個平板上典型菌落數(shù)；
B——單個平板上經確證試驗為產氣莢膜梭菌的菌落數(shù)；
C——單個平板上用于確證試驗的菌落數(shù)；
n 1  ——第一稀釋度（低稀釋倍數(shù)）經確證試驗有產氣莢膜梭菌的平板個數(shù)；
n 2  ——第二稀釋度（高稀釋倍數(shù)）經確證試驗有產氣莢膜梭菌的平板個數(shù)；
0.1——稀釋系數(shù)；
d——稀釋因子（第一稀釋度）。
6.3 報告
根據(jù) TSC 瓊脂平板上產氣莢膜梭菌的典型菌落數(shù)，按照 6.2 中公式計算，報告每 g（mL）樣品中產
氣莢膜梭菌數(shù)，報告單位以 CFU/ g（mL）表示；如 T 值為 0，則以小于 1 乘以最低稀釋倍數(shù)報告。
d n n
C
B
A
T
) 1 . 0 (
) (
2 1 


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附錄 A
培養(yǎng)基和試劑
A.1 胰胨-亞硫酸鹽-環(huán)絲氨酸（TSC）瓊脂
A.1.1 基礎成分
胰胨  15.0 g
大豆胨  5.0 g
酵母粉 5.0 g
焦亞硫酸鈉  1.0 g
檸檬酸鐵銨  1.0 g
瓊脂  15.0 g
蒸餾水  900.0 mL
pH 7.6±0.2 
A.1.2 D-環(huán)絲氨酸溶液
溶解 1 gD-環(huán)絲氨酸于 200 mL 蒸餾水，膜過濾除菌后，于 4 ℃冷藏保存?zhèn)溆谩?br /> A.1.3 制法
將基礎成分加熱煮沸至完全溶解，調節(jié) pH，分裝到 500 mL 燒瓶中，每瓶 250 mL，121 ℃高壓滅菌
15 min，于 50 ℃±1 ℃保溫備用。臨用前每 250 mL 基礎溶液中加入 20 mL D-環(huán)絲氨酸溶液，混勻，傾注
平皿。
A.2 液體硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基（FTG）
A.2.1 成分
胰蛋白胨  15.0 g
L-胱氨酸 0.5g
酵母粉  5.0 g
葡萄糖  5.0 g
氯化鈉  2.5g
硫乙醇酸鈉  0.5g
刃天青  0.001g
瓊脂  0.75g
蒸餾水  1 000.0 mL
pH 7.1±0.2 
A.2.2 制法
將以上成分加熱煮沸至完全溶解，冷卻后調節(jié) pH，分裝試管，每管 10 mL，121 ℃高壓滅菌 15 min。
臨用前煮沸或流動蒸汽加熱 15 min，迅速冷卻至接種溫度。
A.3 緩沖動力-硝酸鹽培養(yǎng)基
A.3.1 成分
蛋白胨  5.0 g
牛肉粉  3.0 g
硝酸鉀  5.0 g
磷酸氫二鈉  2.5g
GB 4789.13—2012
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半乳糖  5.0 g
甘油  5.0 mL
瓊脂  3.0 g
蒸餾水  1 000.0 mL
pH 7.3±0.2 
A.3.2 制法
將以上成分加熱煮沸至完全溶解，調節(jié) pH，分裝試管，每管 10 mL，121 ℃高壓滅菌 15 min。如果
當天不用，置 4 ℃左右冷藏保存。臨用前煮沸或流動蒸汽加熱 15 min，迅速冷卻至接種溫度。
A.4 乳糖-明膠培養(yǎng)基
A.4.1 成分
蛋白胨  15.0 g
酵母粉  10.0 g
乳糖  10.0 g
酚紅  0.05g
明膠  120.0 g
蒸餾水  1 000.0 mL
pH 7.5±0.2 
A.4.2制法
加熱溶解蛋白胨、酵母粉和明膠于 1000 mL 蒸餾水中，調節(jié) pH，加入乳糖和酚紅。分裝試管，每
管 10 mL，121 ℃高壓滅菌 10 min。如果當天不用，置 4 ℃左右冷藏保存。臨用前煮沸或流動蒸汽加熱
15 min，迅速冷卻至接種溫度。
A.5 含鐵牛乳培養(yǎng)基
A.5.1 成分
新鮮全脂牛奶  1 000.0 mL
硫酸亞鐵（FeSO 4 ·7H 2 O）  1.0 g
蒸餾水  50.0 mL
A.5.2 制法
將硫酸亞鐵溶于蒸餾水中，不斷攪拌，緩慢加入 1000 mL 牛奶中，混勻。分裝大試管，每管 10 mL，
118 ℃高壓滅菌 12 min。本培養(yǎng)基必須新鮮配制。
A.6 0.1% 蛋白胨水
A.6.1 成分
蛋白胨  1.0 g
蒸餾水  1 000.0 mL
pH 7.0±0.2 
A.6.2制法
加熱溶解，調節(jié) pH，121 ℃高壓滅菌 15 min。
A.7 革蘭氏染色液
A.7.1 結晶紫染色液
A.7.1.1 成分
結晶紫  1.0g
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95%乙醇  20.0 mL
1%草酸銨水溶液  80.0 mL
A.7.1.2 制法
將結晶紫完全溶于乙醇中，然后與草酸銨溶液混合。
A.7.2 革蘭氏碘液
A.7.2.1 成分
碘  1.0 g
碘化鉀  2.0 g
蒸餾水  300.0 mL
A.7.2.2 制法
將碘與碘化鉀先混合，加入蒸餾水少許振搖，待完全溶解后，再加入蒸餾水至 300 mL。
A.7.3 沙黃復染液
A.7.3.1 成分
沙黃  0.25 g
95%乙醇  10.0 mL
蒸餾水  90.0 mL
A.7.3.2 制法
將沙黃溶解于 95%乙醇中，然后用蒸餾水稀釋。
A.7.4 染色方法
涂片在火焰上固定，滴加結晶紫染液，染色 1 min，水洗。滴加革蘭氏碘液，作用 1 min，水洗。 滴
加 95%乙醇脫色約 15 s～30 s，直至染色液被洗掉，不要過分脫色，水洗。滴加沙黃復染液，復染 1 min，
水洗、待干、鏡檢。
A.8 硝酸鹽還原試劑
A.8.1 甲液（對氨基苯磺酸溶液）
在 1 000 mL 5 mol/L 乙酸中溶解 8 g 對氨基苯磺酸。
A.8.2 乙液（α-萘酚乙酸溶液）
在 1 000 mL 5 mol/L 乙酸中溶解 5 g α-萘酚。
A.9 緩沖甘油-氯化鈉溶液
A.9.1 成分
甘油  100.0 mL
氯化鈉  4.2 g
磷酸氫二鉀（無水）  12.4 g
磷酸二氫鉀（無水）  4.0 g
蒸餾水  900.0 mL
pH7.2±0.1 
A.9.2 制法
將以上成分加熱至完全溶解，調節(jié)pH，121 ℃高壓滅菌15 min。配制雙料緩沖甘油溶液時，用甘油
200 mL和蒸餾水800 mL。