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中 華 人 民 共 和 國 國 家 標 準
GB4789. 12 — 2016
食品安全國家標準
食品微生物學檢驗
肉毒梭菌及肉毒毒素檢驗
2016-12-23 發(fā)布 2017-06-23 實施
中華人民共和國國家衛(wèi)生和計劃生育委員會
國 家 食 品 藥 品 監(jiān) 督 管 理 總 局
發(fā) 布
GB4789. 12 — 2016
Ⅰ
前 言
本標準代替 GB / T4789. 12 — 2003 《食品衛(wèi)生微生物學檢驗 肉毒梭菌及肉毒毒素檢驗》。
本標準與 GB / T4789.
12 — 2003 相比,主要變化如下:
———標準名稱修改為“食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 肉毒梭菌及肉毒毒素檢驗”;
———增加了 PCR 鑒定方法;
———增加了結(jié)果與報告;
———增加了附錄 A ;
———修改了設(shè)備和材料;
———修改了培養(yǎng)基和試劑;
———修改了檢驗程序;
———規(guī)范了樣品制備過程;
———修改了操作步驟中增菌和分離培養(yǎng)部分試驗方法。
GB4789. 12 — 2016
1
食品安全國家標準
食品微生物學檢驗
肉毒梭菌及肉毒毒素檢驗
1  范圍
本標準規(guī)定了食品中肉毒梭菌(
Clostridiumbotulinum )及肉毒毒素( botulinumtoxin )的檢驗
方法。
本標準適用于食品中肉毒梭菌及肉毒毒素的檢驗。
2  設(shè)備和材料
除微生物實驗室常規(guī)滅菌及培養(yǎng)設(shè)備外,其他設(shè)備和材料如下:
2. 1  冰箱: 2℃~5℃ 、 -20℃ 。
2. 2  天平:感量 0. 1g 。
2. 3  無菌手術(shù)剪、鑷子、試劑勺。
2. 4  均質(zhì)器或無菌乳缽。
2. 5  離心機: 3000r / min 、 14000r / min 。
2. 6  厭氧培養(yǎng)裝置。
2. 7  恒溫培養(yǎng)箱: 35℃±1℃ 、 28℃±1℃ 。
2. 8  恒溫水浴箱: 37℃±1℃ 、 60℃±1℃ 、 80℃±1℃ 。
2. 9  顯微鏡: 10 倍 ~100 倍。
2. 10 PCR 儀。
2. 11  電泳儀或毛細管電泳儀。
2. 12  凝膠成像系統(tǒng)或紫外檢測儀。
2. 13  核酸蛋白分析儀或紫外分光光度計。
2. 14  可調(diào)微量移液器: 0. 2 μ L~2 μ L 、 2 μ L~20 μ L 、 20 μ L~200 μ L 、 100 μ L~1000 μ L 。
2. 15  無菌吸管: 1. 0mL 、 10. 0mL 、 25. 0mL 。
2. 16  無菌錐形瓶: 100mL 。
2. 17  培養(yǎng)皿:直徑 90mm 。
2. 18  離心管: 50mL 、 1. 5mL 。
2. 19 PCR 反應(yīng)管。
2. 20  無菌注射器: 1. 0mL 。
2. 21  小鼠: 15g~20g ,每一批次試驗應(yīng)使用同一品系的 KM 或 ICR 小鼠。
3  培養(yǎng)基和試劑
除另有規(guī)定外,
PCR 試驗所用試劑為分析純或符合生化試劑標準,水應(yīng)符合 GB / T6682 中一級水
的要求。
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2
3. 1  庖肉培養(yǎng)基:見 A. 1 。
3. 2  胰蛋白酶胰蛋白胨葡萄糖酵母膏肉湯( TPGYT ):見 A. 2 。
3. 3  卵黃瓊脂培養(yǎng)基:見 A. 3 。
3. 4  明膠磷酸鹽緩沖液:見 A. 4 。
3. 5  革蘭氏染色液:見 A. 5 。
3. 6 10% 胰蛋白酶溶液:見 A. 6 。
3. 7  磷酸鹽緩沖液( PBS ):見 A. 7 。
3. 8 1mol
/ L 氫氧化鈉溶液。
3. 9 1mol
/ L 鹽酸溶液。
3. 10  肉毒毒素診斷血清。
3. 11  無水乙醇和 95% 乙醇。
3. 12 10mg / mL 溶菌酶溶液。
3. 13 10mg / mL 蛋白酶 K 溶液。
3. 14 3mol
/ L 乙酸鈉溶液(
pH5. 2 )。
3. 15 TE 緩沖液。
3. 16  引物:根據(jù)表 1 中序列合成,臨用時用超純水配制引物濃度為 10 μ mol
/ L 。
3. 17 10×PCR 緩沖液。
3. 18 25mmol
/ L MgCl
2 。
3. 19 dNTPs : dATP 、 dTTP 、 dCTP 、 dGTP 。
3. 20
Taq
酶。
3. 21  瓊脂糖:電泳級。
3. 22  溴化乙錠或 Goldview 。
3. 23 5×TBE 緩沖液。
3. 24 6× 加樣緩沖液。
3. 25 DNA 分子量標準。
4  檢驗程序
肉毒梭菌及肉毒毒素檢驗程序見圖 1 。
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圖 1  肉毒梭菌及肉毒毒素檢驗程序
5  操作步驟
5. 1  樣品制備
5. 1. 1  樣品保存
待檢樣品應(yīng)放置 2℃~5℃ 冰箱冷藏。
5. 1. 2  固態(tài)與半固態(tài)食品
固體或游離液體很少的半固態(tài)食品,以無菌操作稱取樣品 25g ,放入無菌均質(zhì)袋或無菌乳缽,塊狀
食品以無菌操作切碎,含水量較高的固態(tài)食品加入 25mL 明膠磷酸鹽緩沖液,乳粉、牛肉干等含水量低
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的食品加入 50mL 明膠磷酸鹽緩沖液,浸泡 30min ,用拍擊式均質(zhì)器拍打 2min 或用無菌研杵研磨制
備樣品勻液,收集備用。
5. 1. 3  液態(tài)食品
液態(tài)食品搖勻,以無菌操作量取 25mL 檢驗。
5. 1. 4  剩余樣品處理
取樣后的剩余樣品放 2℃~5℃ 冰箱冷藏,直至檢驗結(jié)果報告發(fā)出后,按感染性廢棄物要求進行無
害化處理,檢出陽性的樣品應(yīng)采用壓力蒸汽滅菌方式進行無害化處理。
5. 2  肉毒毒素檢測
5. 2. 1  毒素液制備
取樣品勻液約 40mL 或均勻液體樣品 25mL 放入離心管,
3000r / min 離心 10min~20min ,收集
上清液分為兩份放入無菌試管中,一份直接用于毒素檢測,一份用于胰酶處理后進行毒素檢測。液體樣
品保留底部沉淀及液體約 12mL ,重懸,制備沉淀懸浮液備用。
胰酶處理:用 1mol / L 氫氧化鈉或 1mol / L 鹽酸調(diào)節(jié)上清液
pH
至 6.
2 ,按 9 份上清液加 1 份 10%
胰酶(活力 1∶250 )水溶液,混勻,
37℃ 孵育 60min ,期間間或輕輕搖動反應(yīng)液。
5. 2. 2  檢出試驗
用 5 號針頭注射器分別取離心上清液和胰酶處理上清液腹腔注射小鼠 3 只,每只 0.
5mL ,觀察和
記錄小鼠 48h 內(nèi)的中毒表現(xiàn)。典型肉毒毒素中毒癥狀多在 24h 內(nèi)出現(xiàn),通常在 6h 內(nèi)發(fā)病和死亡,其
主要表現(xiàn)為豎毛、四肢癱軟,呼吸困難,呈現(xiàn)風箱式呼吸、腰腹部凹陷、宛如峰腰,多因呼吸衰竭而死亡,
可初步判定為肉毒毒素所致。若小鼠在 24h 后發(fā)病或死亡,應(yīng)仔細觀察小鼠癥狀,必要時濃縮上清液
重復(fù)試驗,以排除肉毒毒素中毒。若小鼠出現(xiàn)猝死(
30min 內(nèi))導(dǎo)致癥狀不明顯時,應(yīng)將毒素上清液進
行適當稀釋,重復(fù)試驗。
注:毒素檢測動物試驗應(yīng)遵循 GB15193.
2 《食品安全國家標準 食品毒理學實驗室操作規(guī)范》的規(guī)定。
5. 2. 3  確證試驗
上清液或(和)胰酶處理上清液的毒素試驗陽性者,取相應(yīng)試驗液 3 份,每份 0.
5mL ,其中第一份加
等量多型混合肉毒毒素診斷血清,混勻,
37℃ 孵育 30min ;第二份加等量明膠磷酸鹽緩沖液,混勻后煮
沸 10min ;第三份加等量明膠磷酸鹽緩沖液,混勻。將三份混合液分別腹腔注射小鼠各兩只,每只
0. 5mL ,觀察 96h 內(nèi)小鼠的中毒和死亡情況。
結(jié)果判定:若注射第一份和第二份混合液的小鼠未死亡,而第三份混合液小鼠發(fā)病死亡,并出現(xiàn)肉
毒毒素中毒的特有癥狀,則判定檢測樣品中檢出肉毒毒素。
5. 2. 4  毒力測定(選做項目)
取確證試驗陽性的試驗液,用明膠磷酸鹽緩沖液稀釋制備一定倍數(shù)稀釋液,如 10 倍、
50 倍、 100 倍、
500 倍等,分別腹腔注射小鼠各兩只,每只 0. 5mL ,觀察和記錄小鼠發(fā)病與死亡情況至 96h ,計算最低
致死劑量( MLD / mL 或 MLD /
g ),評估樣品中肉毒毒素毒力, MLD 等于小鼠全部死亡的最高稀釋倍數(shù)
乘以樣品試驗液稀釋倍數(shù)。例如,樣品稀釋兩倍制備的上清液,再稀釋 100 倍試驗液使小鼠全部死亡,
而 500 倍稀釋液組存活,則該樣品毒力為 200MLD / g 。
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5. 2. 5  定型試驗(選做項目)
根據(jù)毒力測定結(jié)果,用明膠磷酸鹽緩沖液將上清液稀釋至 10MLD / mL~1000MLD / mL 作為定
型試驗液,分別與各單型肉毒毒素診斷血清等量混合(國產(chǎn)診斷血清一般為凍干血清,用 1mL 生理鹽
水溶解),
37℃ 孵育 30min ,分別腹腔注射小鼠兩只,每只 0. 5mL ,觀察和記錄小鼠發(fā)病與死亡情況至
96h 。同時,用明膠磷酸鹽緩沖液代替診斷血清,與試驗液等量混合作為小鼠試驗對照。
結(jié)果判定:某一單型診斷血清組動物未發(fā)病且正常存活,而對照組和其他單型診斷血清組動物發(fā)病
死亡,則判定樣品中所含肉毒毒素為該型肉毒毒素。
注:未經(jīng)胰酶激活處理的樣品上清液的毒素檢出試驗或確證試驗為陽性者,則毒力測定和定型試驗可省略胰酶激
活處理試驗。
5. 3  肉毒梭菌檢驗
5. 3. 1  增菌培養(yǎng)與檢出試驗
5. 3. 1. 1  取出庖肉培養(yǎng)基 4 支和 TPGY 肉湯管 2 支,隔水煮沸 10min~15min ,排除溶解氧,迅速冷
卻,切勿搖動,在 TPGY 肉湯管中緩慢加入胰酶液至液體石蠟液面下肉湯中,每支 1 mL ,制備成
TPGYT 。
5. 3. 1. 2  吸取樣品勻液或毒素制備過程中的離心沉淀懸浮液 2mL 接種至庖肉培養(yǎng)基中,每份樣品接
種 4 支,
2 支直接放置 35℃±1℃ 厭氧培養(yǎng)至 5d ,另 2 支放 80℃ 保溫 10min ,再放置 35℃±1℃ 厭氧
培養(yǎng)至 5d ;同樣方法接種 2 支 TPGYT 肉湯管, 28℃±1℃ 厭氧培養(yǎng)至 5d 。
注:接種時,用無菌吸管輕輕吸取樣品勻液或離心沉淀懸浮液,將吸管口小心插入肉湯管底部,緩緩放出樣液至肉
湯中,切勿攪動或吹氣。
5. 3. 1. 3  檢查記錄增菌培養(yǎng)物的濁度、產(chǎn)氣、肉渣顆粒消化情況,并注意氣味。肉毒梭菌培養(yǎng)物為產(chǎn)氣、
肉湯渾濁(庖肉培養(yǎng)基中 A 型和 B 型肉毒梭菌肉湯變黑)、消化或不消化肉粒、有異臭味。
5. 3. 1. 4  取增菌培養(yǎng)物進行革蘭氏染色鏡檢,觀察菌體形態(tài),注意是否有芽胞、芽胞的相對比例、芽胞在
細胞內(nèi)的位置。
5. 3. 1. 5  若增菌培養(yǎng)物 5d 無菌生長,應(yīng)延長培養(yǎng)至 10d ,觀察生長情況。
5. 3. 1. 6  取增菌培養(yǎng)物陽性管的上清液,按 5. 2 方法進行毒素檢出和確證試驗,必要時進行定型試驗,
陽性結(jié)果可證明樣品中有肉毒梭菌存在。
注: TPGYT 增菌液的毒素試驗無需添加胰酶處理。
5. 3. 2  分離與純化培養(yǎng)
5. 3. 2. 1  增菌液前處理,吸取 1mL 增菌液至無菌螺旋帽試管中,加入等體積過濾除菌的無水乙醇,混
勻,在室溫下放置 1h 。
5. 3. 2. 2  取增菌培養(yǎng)物和經(jīng)乙醇處理的增菌液分別劃線接種至卵黃瓊脂平板, 35 ℃±1 ℃ 厭氧培養(yǎng)
48h 。
5. 3. 2. 3  觀察平板培養(yǎng)物菌落形態(tài),肉毒梭菌菌落隆起或扁平、光滑或粗糙,易成蔓延生長,邊緣不規(guī)
則,在菌落周圍形成乳色沉淀暈圈(
E 型較寬, A 型和 B 型較窄),在斜視光下觀察,菌落表面呈現(xiàn)珍珠樣
虹彩,這種光澤區(qū)可隨蔓延生長擴散到不規(guī)則邊緣區(qū)外的暈圈。
5. 3. 2. 4  菌株純化培養(yǎng),在分離培養(yǎng)平板上選擇 5 個肉毒梭菌可疑菌落,分別接種卵黃瓊脂平板, 35℃±
1℃ ,厭氧培養(yǎng) 48h ,按 5. 3. 2. 3 觀察菌落形態(tài)及其純度。
5. 3. 3  鑒定試驗
5. 3. 3. 1  染色鏡檢
挑取可疑菌落進行涂片、革蘭氏染色和鏡檢,肉毒梭菌菌體形態(tài)為革蘭氏陽性粗大桿菌、芽胞卵圓
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形、大于菌體、位于次端,菌體呈網(wǎng)球拍狀。
5. 3. 3. 2  毒素基因檢測
a ) 菌株活化:挑取可疑菌落或待鑒定菌株接種 TPGY , 35℃±1℃ 厭氧培養(yǎng) 24h 。
b ) DNA 模板制備:吸取 TPGY 培養(yǎng)液 1. 4mL 至無菌離心管中, 14000× g 離心 2min ,棄上清,
加入 1.
0mLPBS 懸浮菌體, 14000× g 離心 2min ,棄上清,用 400 μ LPBS 重懸沉淀,加入
10mg
/ mL 溶菌酶溶液 100 μ L ,搖勻,
37 ℃ 水浴 15 min ,加入 10 mg / mL 蛋白酶 K 溶液
10 μ L ,搖勻, 60℃ 水浴 1h ,再沸水浴 10min , 14000× g 離心 2min ,上清液轉(zhuǎn)移至無菌小離
心管中,加入 3mol / LNaAc 溶液 50 μ L 和 95% 乙醇 1.
0mL ,搖勻, -70 ℃ 或 -20 ℃ 放置
30min , 14000× g 離心 10min ,棄去上清液,沉淀干燥后溶于 200 μ LTE 緩沖液,置于 -20℃ 保
存?zhèn)溆谩?br /> 注:根據(jù)實驗室實際情況,也可采用常規(guī)水煮沸法或商品化試劑盒制備 DNA 模板。
c ) 核酸濃度測定(必要時):取 5 μ LDNA 模板溶液,加超純水稀釋至 1mL ,用核酸蛋白分析儀或
紫外分光光度計分別檢測 260nm 和 280nm 波段的吸光值 A 260 和 A 280 。按式( 1 )計算 DNA
濃度。當濃度在 0.
34 μ g / mL~340 μ g / mL 或 A 260 / A 280 比值在 1. 7~1. 9 之間時,適宜于 PCR
擴增。
C = A 260 × N ×50
…………………………( 1 )
式中:
C ——— DNA 濃度,單位為微克每毫升(
μ g
/ mL );
A 260 ——— 260nm 處的吸光值;
N
———核酸稀釋倍數(shù)。
d ) PCR 擴增:
1 ) 分別采用針對各型肉毒梭菌毒素基因設(shè)計的特異性引物(見表 1 )進行 PCR 擴增,包括 A
型肉毒毒素(
botulinumneurotoxinA , bont / A )、 B 型肉毒毒素( botulinumneurotoxinB ,
bont / B )、 E 型肉毒毒素( botulinumneurotoxinE , bont / E )和 F 型肉毒毒素( botulinum
neurotoxinF , bont / F ),每個 PCR 反應(yīng)管檢測一種型別的肉毒梭菌。
表 1  肉毒梭菌毒素基因 PCR 檢測的引物序列及其產(chǎn)物
檢測肉毒梭菌類型 引物序列 擴增長度/
bp
A 型
F5 ’ -GTGATACAACCAGATGGTAGTTATAG-3 ’
R5 ’ -AAAAAACAAGTCCCAATT ATT AACTTT-3 ’
983
B 型
F5 ’ -GAGATG TTTGTGAAT ATT ATG ATCCAG-3 ’
R5 ’ -GTTCATGCATTAATATCAAGGCTGG-3 ’
492
E 型
F5 ’ -CCAGGCGGTTGTCAAGAATTTTAT-3 ’
R5 ’ -TCAAATAAATCAGGCTCTGCTCCC-3 ’
410
F 型
F5 ’ -GCTTCATTA AAGAACGGAAGCAGTGCT-3 ’
R5 ’ -GTGGCGCCTTTGTACCTTTTCTAGG-3 ’
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2 ) 反應(yīng)體系配制見表 2 ,反應(yīng)體系中各試劑的量可根據(jù)具體情況或不同的反應(yīng)總體積進行
相應(yīng)調(diào)整。
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表 2  肉毒梭菌毒素基因 PCR 檢測的反應(yīng)體系
試劑 終濃度 加入體積/
μ L
10×PCR 緩沖液 1× 5. 0
25mmol / L MgCl 2 2. 5mmol / L 5. 0
10mmol / LdNTPs 0. 2mmol / L 1. 0
10 μ mol / L 正向引物 0. 5 μ mol / L 2. 5
10 μ mol / L 反向引物 0. 5 μ mol / L 2. 5
5U / μ L
Taq
酶
0. 05U / μ L 0. 5
DNA 模板
—
1. 0
ddH 2 O
—
32. 5
總體積 —
50. 0
3 ) 反應(yīng)程序,預(yù)變性 95℃ 、 5min ;循環(huán)參數(shù) 94℃ 、 1min , 60℃ 、 1min , 72℃ 、 1min ;循環(huán)數(shù)
40 ;后延伸 72℃ , 10min ; 4℃ 保存?zhèn)溆谩?br /> 4 ) PCR 擴增體系應(yīng)設(shè)置陽性對照、陰性對照和空白對照。用含有已知肉毒梭菌菌株或含肉
毒毒素基因的質(zhì)控品作陽性對照、非肉毒梭菌基因組 DNA 作陰性對照、無菌水作空白
對照。
e ) 凝膠電泳檢測 PCR 擴增產(chǎn)物,用 0. 5×TBE 緩沖液配制 1. 2%~1. 5% 的瓊脂糖凝膠,凝膠加熱
融化后冷卻至 60℃ 左右加入溴化乙錠至 0.
5 μ g / mL 或 Goldview5 μ L / 100mL 制備膠塊,取
10 μ LPCR 擴增產(chǎn)物與 2. 0 μ L6× 加樣緩沖液混合,點樣,其中一孔加入 DNA 分子量標準。
0. 5×TBE 電泳緩沖液, 10V / cm 恒壓電泳,根據(jù)溴酚藍的移動位置確定電泳時間,用紫外檢
測儀或凝膠成像系統(tǒng)觀察和記錄結(jié)果。
PCR 擴增產(chǎn)物也可采用毛細管電泳儀進行檢測。
f ) 結(jié)果判定,陰性對照和空白對照均未出現(xiàn)條帶,陽性對照出現(xiàn)預(yù)期大小的擴增條帶(見表 1 ),
判定本次 PCR 檢測成立;待測樣品出現(xiàn)預(yù)期大小的擴增條帶,判定為 PCR 結(jié)果陽性,根據(jù)表 1
判定肉毒梭菌菌株型別,待測樣品未出現(xiàn)預(yù)期大小的擴增條帶,判定 PCR 結(jié)果為陰性。
注: PCR 試驗環(huán)境條件和過程控制應(yīng)參照
GB / T27403 《實驗室質(zhì)量控制規(guī)范 食品分子生物學檢測》規(guī)定執(zhí)行。
5. 3. 3. 3  菌株產(chǎn)毒試驗
將 PCR 陽性菌株或可疑肉毒梭菌菌株接種庖肉培養(yǎng)基或 TPGYT 肉湯(用于 E 型肉毒梭菌),按
5. 3. 1. 2 條件厭氧培養(yǎng) 5d ,按 5. 2 方法進行毒素檢測和(或)定型試驗,毒素確證試驗陽性者,判定為肉
毒梭菌,根據(jù)定型試驗結(jié)果判定肉毒梭菌型別。
注:根據(jù) PCR 陽性菌株型別,可直接用相應(yīng)型別的肉毒毒素診斷血清進行確證試驗。
6  結(jié)果報告
6. 1  肉毒毒素檢測結(jié)果報告
根據(jù) 5.
2. 2 和 5. 2. 3 試驗結(jié)果,報告 25g ( mL )樣品中檢出或未檢出肉毒毒素。
根據(jù) 5.
2. 5 定型試驗結(jié)果,報告 25g ( mL )樣品中檢出某型肉毒毒素。
6. 2  肉毒梭菌檢驗結(jié)果報告
根據(jù) 5.
3 各項試驗結(jié)果,報告樣品中檢出或未檢出肉毒梭菌或檢出某型肉毒梭菌。
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附 錄 A
培養(yǎng)基和試劑
A. 1  庖肉培養(yǎng)基
A. 1. 1  成分
新鮮牛肉 500.
0g
蛋白胨
30. 0g
酵母浸膏
5. 0g
磷酸二氫鈉
5. 0g
葡萄糖
3. 0g
可溶性淀粉
2. 0g
蒸餾水
1000. 0mL
A. 1. 2  制法
稱取新鮮除去脂肪與筋膜的牛肉 500.
0g ,切碎,加入蒸餾水 1000mL
和 1mol / L 氫氧化鈉溶液
25mL ,攪拌煮沸 15min ,充分冷卻,除去表層脂肪,紗布過濾并擠出肉渣余液,分別收集肉湯和碎肉渣。
在肉湯中加入成分表中其他物質(zhì)并用蒸餾水補足至 1000mL ,調(diào)節(jié)
pH
至 7.
4±0. 1 ,肉渣涼至半干。
在 20mm×150mm 試管中先加入碎肉渣 1cm~2cm 高,每管加入還原鐵粉 0.
1g~0. 2g 或少許
鐵屑,再加入配制肉湯 15mL ,最后加入液體石蠟覆蓋培養(yǎng)基 0.
3cm~0. 4cm , 121 ℃ 高壓蒸汽滅菌
20min 。
A. 2  胰蛋白酶胰蛋白胨葡萄糖酵母膏肉湯( TPGYT )
A. 2. 1  基礎(chǔ)成分( TPGY 肉湯)
胰酪胨(
trypticase ) 50. 0g
蛋白胨
5. 0g
酵母浸膏
20. 0g
葡萄糖
4. 0g
硫乙醇酸鈉
1. 0g
蒸餾水
1000. 0mL
A. 2. 2  胰酶液
稱取胰酶(
1∶250 ) 1. 5g ,加入 100mL 蒸餾水中溶解,膜過濾除菌, 4℃ 保存?zhèn)溆谩?br /> A. 2. 3  制法
將 A.
2. 1 中成分溶于蒸餾水中,調(diào)節(jié)
pH
至 7.
2±0. 1 ,分裝 20mm×150mm 試管,每管 15mL ,加
入液體石蠟覆蓋培養(yǎng)基 0.
3cm~0. 4cm , 121℃ 高壓蒸汽滅菌 10min 。冰箱冷藏,兩周內(nèi)使用。臨用接
種樣品時,每管加入胰酶液 1.
0mL 。
GB4789. 12 — 2016
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A. 3  卵黃瓊脂培養(yǎng)基
A. 3. 1  基礎(chǔ)培養(yǎng)基成分
酵母浸膏
5. 0g
胰胨
5. 0g
胨(
proteosepeptone )
20. 0g
氯化鈉
5. 0g
瓊脂
20. 0g
蒸餾水
1000. 0mL
A. 3. 2  卵黃乳液
用硬刷清洗雞蛋 2 個 ~3 個,瀝干,殺菌消毒表面,無菌打開,取出內(nèi)容物,棄去蛋白,用無菌注射器
吸取蛋黃,放入無菌容器中,加等量無菌生理鹽水,充分混合調(diào)均,
4℃ 保存?zhèn)溆谩?br /> A. 3. 3  制法
將 A.
3. 1 中成分溶于蒸餾水中,調(diào)節(jié)
pH
至 7.
0±0. 2 ,分裝錐形瓶, 121 ℃ 高壓蒸汽滅菌 15min ,冷
卻至 50℃ 左右,按每 100mL 基礎(chǔ)培養(yǎng)基加入 15mL 卵黃乳液,充分混勻,傾注平板,
35℃ 培養(yǎng) 24h 進
行無菌檢查后,冷藏備用。
A. 4  明膠磷酸鹽緩沖液
A. 4. 1  成分
明膠
2. 0g
磷酸氫二鈉( Na
2 HPO 4 ) 4. 0g
蒸餾水
1000. 0mL
A. 4. 2  制法
將 A.
4. 1 中成分溶于蒸餾水中,調(diào)節(jié)
pH
至 6.
2 , 121℃ 高壓蒸汽滅菌 15min 。
A. 5  革蘭氏染色
A. 5. 1  結(jié)晶紫染色液
A. 5. 1. 1  成分
結(jié)晶紫
1. 0g
95% 乙醇 20. 0mL
1% 草酸銨水溶液 80. 0mL
A. 5. 1. 2  制法
將結(jié)晶紫完全溶于乙醇中,再與草酸銨溶液混合。
GB4789. 12 — 2016
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A. 5. 2  革蘭氏碘液
A. 5. 2. 1  成分
碘
1. 0g
碘化鉀
2. 0g
蒸餾水
300. 0mL
A. 5. 2. 2  制法
將碘和碘化鉀混合,加入少許蒸餾水充分振搖,待完全溶解后,再加蒸餾水至 300mL 。
A. 5. 3  沙黃復(fù)染液
A. 5. 3. 1  成分
沙黃
0. 25g
95% 乙醇 10. 0mL
蒸餾水
90. 0mL
A. 5. 3. 2  制法
將沙黃溶于乙醇中,再加蒸餾水至 100mL 。
A. 5. 4  染色方法
涂片在酒精燈火焰上固定,滴加結(jié)晶紫染色液覆蓋,染色 1min ,水洗;滴加革蘭氏碘液覆蓋,作用
1min ,水洗;滴加 95% 乙醇脫色約 15s~30s (可將乙醇覆蓋整個涂片,立即傾去,再用乙醇覆蓋涂片,
作用約 10s ,傾去脫色液,滴加乙醇從涂片流下至出現(xiàn)無色為止),水洗;滴加沙黃復(fù)染液覆蓋,染色
1min ,水洗,待干、鏡檢。
A. 6  胰蛋白酶溶液
A. 6. 1  成分
胰蛋白酶(
1∶250 ) 10.0g
蒸餾水
100. 0mL
A. 6. 2  制法
將胰蛋白酶溶于蒸餾水中,膜過濾除菌,
4℃ 保存?zhèn)溆谩?br /> A. 7  磷酸鹽緩沖液( PBS )
A. 7. 1  成分
氯化鈉
7. 650g
磷酸氫二鈉
0. 724g
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磷酸二氫鉀
0. 210g
超純水
1000. 0mL
A. 7. 2  制法
準確稱取 A.
7. 1 中化學試劑,溶于超純水中,測試 pH7. 4 。