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山東拓普生物工程有限公司

Shandong Tuopu Biol-Engineering Co.,Ltd

新藥申報(bào)時(shí)，藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中分析方法必須驗(yàn)證；藥物生產(chǎn)工藝變更、制劑的組分變更、原分析方法進(jìn)行修訂時(shí)，則質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法必須進(jìn)行驗(yàn)證；2005版藥典中分析方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則只規(guī)定了項(xiàng)目和基本方法而沒有合格標(biāo)準(zhǔn):附錄XIX A；中國(guó)GMP(98)非常關(guān)注驗(yàn)證的過(guò)程,分析方法驗(yàn)證不完善是常見的問題

藥物分析檢驗(yàn)時(shí)藥品生產(chǎn)的GMP的藥物分析的方法學(xué)驗(yàn)證，是保證藥物分析結(jié)果準(zhǔn)確性的前提和基礎(chǔ)，也是實(shí)現(xiàn)藥物分析檢測(cè)GMP的必然要素。

構(gòu)成藥物分析中的檢測(cè)方法驗(yàn)證，這要涉及到以下些方面的內(nèi)容：

1、分析方法驗(yàn)證成功的前提條件：

（1）儀器已經(jīng)確認(rèn)、校正并在有效期內(nèi)

（2）經(jīng)過(guò)培訓(xùn)的人員

（3）可靠穩(wěn)定的對(duì)照品

（4）可靠穩(wěn)定的實(shí)驗(yàn)試劑

（5）確認(rèn)受試溶液的穩(wěn)定性，在規(guī)定時(shí)間內(nèi)無(wú)降解。

2、分析方法學(xué)驗(yàn)證所要求驗(yàn)證的內(nèi)容：

（1）含量的測(cè)定

（2）雜質(zhì)的含量測(cè)定

（3）藥物的定性鑒定

（4）藥物的含量均勻度測(cè)定

（5）藥物的微生物檢測(cè)

（6）藥物的細(xì)菌內(nèi)毒素的檢測(cè)

驗(yàn)證內(nèi)容：

準(zhǔn)確度：準(zhǔn)確度是指用該方法測(cè)定的結(jié)果與真實(shí)值或參考值接近的程度，用百分回收率表示。

測(cè)定回收率R（recovery）的具體方法可采用加樣回收試驗(yàn)法來(lái)進(jìn)行測(cè)定。加樣回收試驗(yàn)已準(zhǔn)確測(cè)定藥物含量P的真實(shí)樣品+已知量A的對(duì)照品（或標(biāo)準(zhǔn)品）測(cè)定，測(cè)定值為M。數(shù)據(jù)要求:規(guī)定的范圍內(nèi)，至少用9次測(cè)定結(jié)果評(píng)價(jià)，如制備高、中、低三個(gè)不同濃度樣品各測(cè)三次

精密度：（重復(fù)性、中間精密度和重現(xiàn)性精密度是指在規(guī)定條件下，同一個(gè)均勻樣品，經(jīng)多次取樣測(cè)定所得結(jié)果之間的接近程度。用偏差（d）、標(biāo)準(zhǔn)偏差(SD)、相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)（變異系數(shù)，CV）表示。

（1）重復(fù)性(repeatability):在相同條件下，由同一個(gè)分析人員測(cè)定所得結(jié)果的精密度；在規(guī)定的范圍內(nèi)，至少用9次測(cè)定結(jié)果評(píng)價(jià)，如制備三個(gè)不同濃度樣品各測(cè)三次或把被測(cè)物濃度當(dāng)作100%，至少測(cè)6次進(jìn)行評(píng)價(jià)。

（2）中間精密度同一實(shí)驗(yàn)室，不同時(shí)間由不同分析人員用不同設(shè)備所得結(jié)果的精密度。

（3）重現(xiàn)性(reproducibility)不同實(shí)驗(yàn)室，不同分析人員測(cè)定結(jié)果的精密度

（4）數(shù)據(jù)要求：需報(bào)告SD，RSD和可信限。

專屬性：指有其他成分（雜質(zhì)、降解物、輔料等）可能存在情況下采用的方法能準(zhǔn)確測(cè)定出被測(cè)物的特性，能反映該方法在有共存物時(shí)對(duì)供試物準(zhǔn)確而專屬的測(cè)定能力，是指該法用于復(fù)雜樣品分析時(shí)是否受到相互干擾程度的度量

•通常通過(guò)分析含有加了雜質(zhì)、降解產(chǎn)物、有關(guān)化學(xué)物質(zhì)或安慰劑成分的樣品，將所獲分析結(jié)果與未加前述成分之樣品的測(cè)試結(jié)果進(jìn)行比較，兩組測(cè)試結(jié)果之差即專屬性

•鑒別反應(yīng)---應(yīng)能與可能共存的物質(zhì)或結(jié)構(gòu)相似化合物區(qū)別，不含被分析的樣品，以及結(jié)構(gòu)相似或組分中的有關(guān)化合物，均應(yīng)呈負(fù)反應(yīng)

•含量測(cè)定和雜質(zhì)測(cè)定---色譜法和其他方法，應(yīng)附代表性圖譜，亦說(shuō)明專屬性。圖中應(yīng)標(biāo)明各組份的位置，色譜法中的分離度應(yīng)符合要求

•雜質(zhì)可獲得的情況下，對(duì)于含量測(cè)定，試樣中可加入雜質(zhì)或輔料，考察測(cè)試結(jié)果是否受干擾；對(duì)于雜質(zhì)測(cè)定，也可向試樣中加入一定量的雜質(zhì)，考察雜質(zhì)間是否得到分離

檢測(cè)限：檢測(cè)限系指試樣在確定的實(shí)驗(yàn)條件下，被測(cè)物能被檢測(cè)出的最低濃度或含量。它是限度檢驗(yàn)效能指標(biāo)，無(wú)需定量測(cè)定，只要指出高于或低于該規(guī)定濃度即可。

•非儀器分析目視法：用已知濃度的被測(cè)物，試驗(yàn)出能被可靠地檢測(cè)出的最低濃度或量

•信噪比法:用于能顯示基線噪音的分析方法（儀器分析方法），是把已知低濃度試樣測(cè)出的信號(hào)與空白樣品測(cè)出的信號(hào)進(jìn)行比較，算出能被可靠地檢測(cè)出的最低濃度或量。一般以信噪比3∶1或2∶1時(shí)的相應(yīng)濃度或注入儀器的量確定檢測(cè)限

•也可采用標(biāo)準(zhǔn)差法：空白值＝0時(shí)；①測(cè)定背景10次以上，求出標(biāo)準(zhǔn)差σ

②將σ乘以三倍；③在工作曲線上求出3σ相對(duì)應(yīng)的濃度X，即為方法的檢出值；空白值不等于0；①測(cè)定背景10次以上，求出標(biāo)準(zhǔn)差σ；②將σ乘以三倍；③在工作曲線上求出3σ相對(duì)應(yīng)的濃度X；④將求得的對(duì)應(yīng)濃度值加上空白值即得該方法的檢出限

定量限（limit ofquantitation LOQ）

•指樣品中被測(cè)物能被定量測(cè)定的最低量，結(jié)果應(yīng)具有一定準(zhǔn)確度和精密度要求

•常用信噪比法確定定量限，一般以信噪比（S/N）為10∶1時(shí)相應(yīng)的濃度或注入儀器的量進(jìn)行確定，也可用儀器所測(cè)空白背景響應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)差（SD）的10倍為估計(jì)值，再經(jīng)試驗(yàn)確定方法的實(shí)際測(cè)定下限

線性：在設(shè)計(jì)的范圍內(nèi)，測(cè)試結(jié)果與試樣中被測(cè)物濃度直接呈正比關(guān)系的程度。線形通常用最小二乘法處理數(shù)據(jù)求得回歸曲線的斜率（Slope）來(lái)表示。數(shù)據(jù)要求：至少需要五個(gè)濃度考察線形，需提供相關(guān)系數(shù)、y截距（是檢定的可能偏差）、回歸斜率及方差等參數(shù)，應(yīng)列出回歸方程數(shù)和線性圖

注意：做線性時(shí)，應(yīng)注意盡量做的點(diǎn)多一點(diǎn)、線性濃度范圍寬一點(diǎn)，這樣做的好處是：當(dāng)你在準(zhǔn)確度考察時(shí)，你做的回收率考察的濃度就大些，配制溶液時(shí)就容易操作些，否者，在你做線性考察時(shí)，你做的線性濃度范圍不寬，那么你在考察回收率時(shí)，你采用加入法考察時(shí)的濃度變化范圍不寬，操作濃度很難控制，造成實(shí)際操作困難。我碰到一個(gè)在做方法學(xué)研究的人，由于她在考察線性時(shí)，做的線性濃度不大，在做回收率時(shí)，加入后的量造成回收率濃度超出線性考察范圍的濃度，我說(shuō)那樣是不行的。因?yàn)樵谧龇治鲇?jì)算時(shí)又恰恰用了線性關(guān)系來(lái)計(jì)算，結(jié)果肯定是值得懷疑，結(jié)果是不能令人肯定的�。ㄟ@是經(jīng)驗(yàn)總結(jié)

范圍：指達(dá)到一定精密度、準(zhǔn)確度和線性的條件下，測(cè)試方法適用的高、低限濃度或量的區(qū)間。范圍應(yīng)根據(jù)分析方法的具體應(yīng)用和線性、準(zhǔn)確度、精密度結(jié)果和要求確定。

•原料藥和制劑含量測(cè)定范圍為80%-120%；制劑含量均勻度范圍為70%-130%；雜質(zhì)測(cè)定應(yīng)為被測(cè)雜質(zhì)匯報(bào)值到限度的120%；溶出度應(yīng)為測(cè)定范圍的±20%，如規(guī)定了限度范圍，應(yīng)為下限的-20%至上限的+20%，例如緩釋片1h<20%,7h>70%，則驗(yàn)證范圍定為0-90%。

耐用性：指測(cè)定條件稍有變動(dòng)時(shí)，結(jié)果不受影響的承受程度，為常規(guī)檢驗(yàn)提供依據(jù)。是衡量實(shí)驗(yàn)室和工作人員之間在正常情況下實(shí)驗(yàn)結(jié)果重現(xiàn)性的尺度;如果方法易受到分析條件的影響，或要求苛刻，應(yīng)注明。典型的變動(dòng)包括：分析溶液的穩(wěn)定性，提取時(shí)間等。

藥物分析的方法學(xué)驗(yàn)證事項(xiàng)(二)

含量測(cè)定方法驗(yàn)證的接收標(biāo)準(zhǔn)

*容量分析法：用原料藥精制品(含量&gt;99.5％)或?qū)φ掌房疾旆椒ǖ木�密��，相�?duì)標(biāo)準(zhǔn)差一般應(yīng)不大于0.2％；進(jìn)行回收率試驗(yàn)。回收率一般在99.7～100.3％之間

*UV法：用適當(dāng)濃度的精制品進(jìn)行測(cè)定，其RSD一般不大于1％。制劑的測(cè)定，回收率一般應(yīng)在98％～102％之間；線性：吸光度A一般在0.2～0.7，濃度點(diǎn)n＝5。用濃度c對(duì)A作線性回歸處理，得一直線方程，r應(yīng)達(dá)到0.9999(n＝5)，方程的截距應(yīng)近于零含量測(cè)定方法驗(yàn)證的接收標(biāo)準(zhǔn)

*HPLC法：

*要求RSD&lt;2％，回收率98％～102％之間。

*線性范圍：用精制品配制一系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，濃度點(diǎn)n應(yīng)為5～7，用濃度c對(duì)峰高h(yuǎn)或被測(cè)物的響應(yīng)值之比進(jìn)行回歸處理，建立回歸方程，r應(yīng)大于0.999，截距應(yīng)趨于零。

分析方法驗(yàn)證步驟：

*驗(yàn)證方案的制訂

*驗(yàn)證目的、方法改進(jìn)背景、

*提供的原料藥和產(chǎn)品、儀器概要、試劑、對(duì)照品

*待驗(yàn)證的方法，項(xiàng)目，合格標(biāo)準(zhǔn)

*實(shí)施人員的培訓(xùn)

*參考文獻(xiàn)

*驗(yàn)證的實(shí)施

*收集完整的驗(yàn)證過(guò)程記錄和原始圖譜

*復(fù)核

*驗(yàn)證報(bào)告

*評(píng)價(jià)該方法是否通過(guò)驗(yàn)證

方法確認(rèn)和方法轉(zhuǎn)移

*對(duì)新產(chǎn)品的方法驗(yàn)證通常在產(chǎn)品開發(fā)階段完成；大規(guī)模生產(chǎn)后的驗(yàn)證通常包括方法確認(rèn)和方法轉(zhuǎn)移

*分析方法確認(rèn)是指當(dāng)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)或藥典標(biāo)準(zhǔn)擬變化或已經(jīng)變化時(shí)在本實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行的對(duì)所涉及

產(chǎn)品是否適用的確認(rèn)實(shí)驗(yàn)

*確認(rèn)之前應(yīng)對(duì)新舊方法進(jìn)行核對(duì)，標(biāo)明所有變更細(xì)節(jié)

*檢驗(yàn)樣品的信息（批號(hào)、規(guī)格),變更項(xiàng)目的接收標(biāo)準(zhǔn)

*確認(rèn)試驗(yàn)的樣品通常包括正常產(chǎn)品、穩(wěn)定性產(chǎn)品

*方法轉(zhuǎn)移指檢驗(yàn)方法由轉(zhuǎn)移方轉(zhuǎn)移至接收方時(shí)進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)。

*流動(dòng)相PH（±0.5)

*流動(dòng)相組成(有機(jī)相±5%）

*色譜柱（同一廠家的三個(gè)批號(hào)，或兩個(gè)不同廠家（同固定相和填充物，尺寸）

*溫度（20-25C)和流速(±10%）

*檢測(cè)波長(zhǎng)(±5nm)

檢驗(yàn)項(xiàng)目和驗(yàn)證內(nèi)容總結(jié)

*鑒別試驗(yàn)除專屬性、耐用性外，其它都不要求。

*雜質(zhì)的限度檢查除專屬性、檢測(cè)限、耐用性外，其它都不要求

*雜質(zhì)的定量測(cè)定除檢測(cè)限外，其它都要求。

*含量測(cè)定及溶出量測(cè)定除檢測(cè)限、定量限外，其它都要求