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山東拓普生物工程有限公司

Shandong Tuopu Biol-Engineering Co.,Ltd

中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)
GB 4789.14—2014
食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)
食品微生物學(xué)檢驗 蠟樣芽胞桿菌檢驗
（）
2014-12-01 發(fā)布  2015-05-01 實施
GB 4789.14—2014
I
前 言
本標(biāo)準(zhǔn)代替 GB/T 4789.14-2003《食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗 蠟樣芽胞桿菌檢驗》。
本標(biāo)準(zhǔn)與 GB/T 4789.14-2003 相比，主要變化如下：
——修改了標(biāo)準(zhǔn)的中文名稱；
——增加了第二法 蠟樣芽胞桿菌 MPN 計數(shù)法；
——將選擇性分離培養(yǎng)基（MYP）培養(yǎng)條件由 37 ℃培養(yǎng) 12 h～20 h 改為 30 ℃±1 ℃培養(yǎng) 24 h～
48 h；
——增加了溶菌酶試驗；
——修改了操作步驟；
——增加了附錄 A、附錄 B。
GB 4789.14—2014
1
食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)
食品微生物學(xué)檢驗 蠟樣芽胞桿菌檢驗
1 范圍
本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了食品中蠟樣芽胞桿菌（Bacillus cereus）的檢驗方法。
本標(biāo)準(zhǔn)第一法適用于蠟樣芽胞桿菌含量較高的食品中蠟樣芽胞桿菌的計數(shù)；第二法適用于蠟樣芽胞桿
菌含量較低的食品樣品中蠟樣芽胞桿菌的計數(shù)。
2 設(shè)備和材料
除微生物實驗室常規(guī)滅菌及培養(yǎng)設(shè)備外，其他設(shè)備和材料如下：
a)  冰箱：2 ℃～5 ℃；
b)  恒溫培養(yǎng)箱：30 ℃±1 ℃、36 ℃±1 ℃；
c)  均質(zhì)器；
d)  電子天平：感量 0.1 g ；
e)  無菌錐形瓶：100 mL、500 mL；
f)  無菌吸管：1 mL（具 0.01 mL 刻度）、10 mL（具 0.1 mL 刻度）或微量移液器及吸頭；
g)  無菌平皿：直徑 90 mm；
h)  無菌試管：18 mm×180 mm；
i)  顯微鏡：10 倍～100 倍（油鏡）；
j)  L 涂布棒。
3 培養(yǎng)基和試劑
3.1 磷酸鹽緩沖液（PBS）：見附錄 A 中 A.1。
3.2 甘露醇卵黃多黏菌素（MYP）瓊脂：見附錄 A 中 A.2。
3.3 胰酪胨大豆多黏菌素肉湯：見附錄 A 中 A.3。
3.4 營養(yǎng)瓊脂：見附錄 A 中 A.4。
3.5 過氧化氫溶液：見附錄 A 中 A.5。
3.6 動力培養(yǎng)基：見附錄 A 中 A.6。
3.7 硝酸鹽肉湯：見附錄 A 中 A.7。
3.8 酪蛋白瓊脂：見附錄 A 中 A.8。
3.9 硫酸錳營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基：見附錄 A 中 A.9。
3.10 0.5%堿性復(fù)紅：見附錄 A 中 A.10。
3.11 動力培養(yǎng)基：見附錄 A 中 A.11。
3.12 糖發(fā)酵管：見附錄 A 中 A.12。
3.13 V-P 培養(yǎng)基：見附錄 A 中 A.13。
3.14 胰酪胨大豆羊血（TSSB）瓊脂：見附錄 A 中 A.14。
3.15 溶菌酶營養(yǎng)肉湯：見附錄 A 中 A.15。
3.16 西蒙氏檸檬酸鹽培養(yǎng)基：見附錄 A 中 A.16。
3.17 明膠培養(yǎng)基：見附錄 A 中 A.17。
GB 4789.14—2014
2
4 蠟樣芽胞桿菌平板計數(shù)法（第一法）
4.1 檢驗程序
蠟樣芽胞桿菌平板計數(shù)法檢驗程序見圖 1。
圖 圖  1  蠟樣芽胞桿菌平板計數(shù)法 檢驗程序
圖 1 蠟樣芽胞桿菌平板計數(shù)法檢驗程序
4.2 操作步驟
4.2.1 樣品處理
冷凍樣品應(yīng)在 45 ℃以下不超過 15 min 或在 2 ℃～5 ℃不超過 18 h 解凍，若不能及時檢驗，應(yīng)放于
-10 ℃ ~ -20 ℃保存；非冷凍而易腐的樣品應(yīng)盡可能及時檢驗，若不能及時檢驗，應(yīng)置于 2 ℃～5 ℃冰箱
保存，24 h 內(nèi)檢驗。
4.2.2 樣品制備
稱取樣品 25 g，放入盛有 225 mL PBS 或生理鹽水的無菌均質(zhì)杯內(nèi)，用旋轉(zhuǎn)刀片式均質(zhì)器以 8000
r/min～10000 r/min 均質(zhì) 1 min～2 min，或放入盛有 225 mL PBS 或生理鹽水的無菌均質(zhì)袋中，用拍擊式
均質(zhì)器拍打 1 min～2 min。若樣品為液態(tài)，吸取 25 mL 樣品至盛有 225 mL PBS 或生理鹽水的無菌錐形
瓶(瓶內(nèi)可預(yù)置適當(dāng)數(shù)量的無菌玻璃珠)中，振蕩混勻，作為 1:10 的樣品勻液。
4.2.3 樣品的稀釋
吸取 4.2.2 中 1:10 的樣品勻液 1 mL 加到裝有 9 mL PBS 或生理鹽水的稀釋管中，充分混勻制成 1:100
的樣品勻液。跟據(jù)對樣品污染狀況的估計，按上述操作，依次制成十倍遞增系列稀釋樣品勻液。每遞增
稀釋 1 次，換用 1 支 1mL 無菌吸管或吸頭。
10 倍系列稀釋
檢樣
25 g(或 25mL)樣品+225 mL 稀釋液，均質(zhì)
選取 2 個～3 個適宜的連續(xù)稀釋度的樣品勻液，涂布
MYP 瓊脂平板
典型菌落計數(shù)及確定鑒定
報 告
30 ℃±1 ℃  24 h～48 h
GB 4789.14—2014
3
4.2.4 樣品接種
根據(jù)對樣品污染狀況的估計，選擇 2 個～3 個適宜稀釋度的樣品勻液（液體樣品可包括原液），以 0.3
mL、0.3 mL、0.4 mL 接種量分別移入三塊 MYP 瓊脂平板，然后用無菌 L 棒涂布整個平板，注意不要觸
及平板邊緣。使用前，如 MYP 瓊脂平板表面有水珠，可放在 25 ℃～50 ℃的培養(yǎng)箱里干燥，直到平板表
面的水珠消失。
4.2.5 分離、培養(yǎng)
4.2.5.1 分離
在通常情況下，涂布后，將平板靜置 10 min。如樣液不易吸收，可將平板放在培養(yǎng)箱 30 ℃±1 ℃培
養(yǎng) 1 h，等樣品勻液吸收后翻轉(zhuǎn)平皿，倒置于培養(yǎng)箱，30 ℃±1 ℃培養(yǎng) 24 h±2 h。如果菌落不典型，可繼
續(xù)培養(yǎng) 24 h±2 h 再觀察。在 MYP 瓊脂平板上，典型菌落為微粉紅色(表示不發(fā)酵甘露醇)，周圍有白色至
淡粉紅色沉淀環(huán)（表示產(chǎn)卵磷脂酶）。
4.2.5.2 純培養(yǎng)
從每個平板（符合 4.4.1.1 要求的平板）中挑取至少 5 個典型菌落（小于 5 個全選），分別劃線接種
于營養(yǎng)瓊脂平板做純培養(yǎng)，30 ℃±1 ℃培養(yǎng) 24 h±2 h，進(jìn)行確證實驗。在營養(yǎng)瓊脂平板上，典型菌落為灰
白色，偶有黃綠色，不透明，表面粗糙似毛玻璃狀或融蠟狀，邊緣常呈擴展?fàn)�，直徑�?4 mm～10 mm。
4.3 確定鑒定
4.3.1 染色鏡檢
挑取純培養(yǎng)的單個菌落，革蘭氏染色鏡檢。蠟樣芽胞桿菌為革蘭氏陽性芽胞桿菌，大小為（1 μm～
1.3 μm）×（3 μm～5 μm），芽胞呈橢圓形位于菌體中央或偏端，不膨大于菌體，菌體兩端較平整，多呈
短鏈或長鏈狀排列。
4.3.2 生化鑒定
4.3.2.1 概述
挑取純培養(yǎng)的單個菌落，進(jìn)行過氧化氫酶試驗、動力試驗、硝酸鹽還原試驗、酪蛋白分解試驗、溶
菌酶耐性試驗、V-P 試驗、葡萄糖利用(厭氧)試驗、根狀生長試驗、溶血試驗、蛋白質(zhì)毒素結(jié)晶試驗。蠟
樣芽胞桿菌生化特征與其他芽胞桿菌的區(qū)別見表 1。
表1 蠟樣芽胞桿菌生化特征與其他芽胞桿菌的區(qū)別
項目
蠟樣芽胞桿菌
Bacillus cereus
蘇云金芽胞桿菌
Bacillus
thuringiensis
蕈狀芽胞桿菌
Bacillus
mycoides
炭疽芽胞桿菌
Bacillus anthracis
巨大芽胞桿菌
Bacillus megaterium
革蘭氏染色  +  +  +  +  +
過氧化氫酶  +  +  +  +  +
動力  +/-  +/-  -  -  +/-
硝酸鹽還原  +  +/-  +  +  -/+
酪蛋白分解  +  +  +/-  -/+  +/-
溶菌酶耐性  +  +  +  +  -
卵黃反應(yīng)  +  +  +  +  -
GB 4789.14—2014
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表 1 （續(xù)）
項目
蠟樣芽胞桿菌
Bacillus cereus
蘇云金芽胞桿菌
Bacillus
thuringiensis
蕈狀芽胞桿菌
Bacillus
mycoides
炭疽芽胞桿菌
Bacillus anthracis
巨大芽胞桿菌
Bacillus megaterium
葡萄糖利用（厭氧）  +  +  +  +  -
V-P試驗  +  +  +  +  -
甘露醇產(chǎn)酸  -  -  -  -  +
溶血（羊紅細(xì)胞）  +  +  +  -/+  -
根狀生長  -  -  +  -  -
蛋白質(zhì)毒素晶體  -  +  -  -  -
注：+ 表示 90%～100%的菌株陽性；- 表示 90%～100%的菌株陰性；+/- 表示大多數(shù)的菌株陽性；-/+ 表示大多數(shù)的菌株
陰性。
4.3.2.2 動力試驗
用接種針挑取培養(yǎng)物穿刺接種于動力培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng) 24h。有動力的蠟樣芽胞桿菌應(yīng)沿穿刺線
呈擴散生長，而蕈狀芽孢桿菌常呈“絨毛狀”生長。也可用懸滴法檢查。
4.3.2.3 溶血試驗
挑取純培養(yǎng)的單個可疑菌落接種于 TSSB 瓊脂平板上，30 ℃±1 ℃培養(yǎng) 24 h±2 h。蠟樣芽胞桿菌菌落
為淺灰色，不透明，似白色毛玻璃狀，有草綠色溶血環(huán)或完全溶血環(huán)。蘇云金芽胞桿菌和蕈狀芽胞桿菌
呈現(xiàn)弱的溶血現(xiàn)象，而多數(shù)炭疽芽胞桿菌為不溶血，巨大芽胞桿菌為不溶血。
4.3.2.4 根狀生長試驗
挑取單個可疑菌落按間隔2 cm～3 cm左右距離劃平行直線于經(jīng)室溫干燥1d～2d的營養(yǎng)瓊脂平板上，
30 ℃±1 ℃培養(yǎng) 24 h～48 h，不能超過 72h。用蠟樣芽胞桿菌和蕈狀芽胞桿菌標(biāo)準(zhǔn)株作為對照進(jìn)行同步試
驗。蕈狀芽胞桿菌呈根狀生長的特征。蠟樣芽胞桿菌菌株呈粗糙山谷狀生長的特征。
4.3.2.5 溶菌酶耐性試驗
用接種環(huán)取純菌懸液一環(huán)，接種于溶菌酶肉湯中，36 ℃±1 ℃培養(yǎng) 24 h。蠟樣芽胞桿菌在本培養(yǎng)基
（含 0.001%溶菌酶）中能生長。如出現(xiàn)陰性反應(yīng)，應(yīng)繼續(xù)培養(yǎng) 24 h。巨大芽胞桿菌不生長。
4.3.2.6 蛋白質(zhì)毒素結(jié)晶試驗
挑取純培養(yǎng)的單個可疑菌落接種于硫酸錳營養(yǎng)瓊脂平板上，30 ℃±1 ℃培養(yǎng) 24 h±2 h，并于室溫放置
3 d～4 d，挑取培養(yǎng)物少許于載玻片上，滴加蒸餾水混勻并涂成薄膜。經(jīng)自然干燥，微火固定后，加甲醇
作用 30 s 后傾去，再通過火焰干燥，于載玻片上滴滿 0.5%堿性復(fù)紅，放火焰上加熱（微見蒸氣，勿使染
液沸騰)持續(xù) 1 min～2 min，移去火焰，再更換染色液再次加溫染色 30 s，傾去染液用潔凈自來水徹底清
洗、晾干后鏡檢。觀察有無游離芽胞（淺紅色）和染成深紅色的菱形蛋白結(jié)晶體。如發(fā)現(xiàn)游離芽胞形成
的不豐富，應(yīng)再將培養(yǎng)物置室溫 2 d～3 d 后進(jìn)行檢查。除蘇云金芽胞桿菌外，其他芽胞桿菌不產(chǎn)生蛋白
結(jié)晶體。
4.3.3 生化分型(選做項目)
根據(jù)對檸檬酸鹽利用、硝酸鹽還原、淀粉水解、V-P 試驗反應(yīng)、明膠液化試驗，將蠟樣芽胞桿菌分
成不同生化型別，見表 2。
GB 4789.14—2014
5
表 2 蠟樣芽胞桿菌生化分型試驗
型別
生化試驗
檸檬酸鹽  硝酸鹽  淀粉  V-P  明膠
1  ＋  ＋  ＋  ＋  ＋
2  －  ＋  ＋  ＋  ＋
3  ＋  ＋  －  ＋  ＋
4  －  －  ＋  ＋  ＋
5  －  －  －  ＋  ＋
6  ＋  －  －  ＋  ＋
7  ＋  －  ＋  ＋  ＋
8  －  ＋  －  ＋  ＋
9  －  ＋  －  －  ＋
10  －  ＋  ＋  －  ＋
11  ＋  ＋  ＋  －  ＋
12  ＋  ＋  －  －  ＋
13  －  －  ＋  －  －
14  ＋  －  －  －  ＋
15  ＋  －  ＋  －  ＋
注：＋表示 90%～100%的菌株陽性；－表示 90%～100%的菌株陰性。
4.4 結(jié)果計算
4.4.1 典型菌落計數(shù)和確認(rèn)
4.4.1.1 選擇有典型蠟樣芽胞桿菌菌落的平板，且同一稀釋度 3 個平板所有菌落數(shù)合計在 20 CFU～200
CFU 之間的平板，計數(shù)典型菌落數(shù)。如果出現(xiàn) a）~f）現(xiàn)象按 4.4.2.1 中公式（1）計算，如果出現(xiàn) g）現(xiàn)
象則按 4.4.2.2 中公式（2）計算；
a）只有一個稀釋度的平板菌落數(shù)在 20 CFU～200 CFU 之間且有典型菌落，計數(shù)該稀釋度平板上的
典型菌落；
b）2 個連續(xù)稀釋度的平板菌落數(shù)均在 20 CFU～200 CFU 之間，但只有一個稀釋度的平板有典型菌
落，應(yīng)計數(shù)該稀釋度平板上的典型菌落；
c）所有稀釋度的平板菌落數(shù)均小于 20 CFU 且有典型菌落，應(yīng)計數(shù)最低稀釋度平板上的典型菌落；
d）某一稀釋度的平板菌落數(shù)大于 200 CFU 且有典型菌落，但下一稀釋度平板上沒有典型菌落，應(yīng)
計數(shù)該稀釋度平板上的典型菌落；
e）所有稀釋度的平板菌落數(shù)均大于 200 CFU 且有典型菌落，應(yīng)計數(shù)最高稀釋度平板上的典型菌落；
f）所有稀釋度的平板菌落數(shù)均不在 20 CFU～200 CFU 之間且有典型菌落，其中一部分小于 20 CFU
或大于 200 CFU 時，應(yīng)計數(shù)最接近 20 CFU 或 200 CFU 的稀釋度平板上的典型菌落。
g) 2 個連續(xù)稀釋度的平板菌落數(shù)均在 20 CFU～200 CFU 之間且均有典型菌落。
4.4.1.2 從毎個平板中至少挑取 5 個典型菌落（小于 5 個全選），劃線接種于營養(yǎng)瓊脂平板做純培養(yǎng)，
30 ℃±1 ℃培養(yǎng) 24 h±2 h。
4.4.2 計算公式
4.4.2.1 菌落計算公式（1）
GB 4789.14—2014
6
T =
Cd
AB
…………………………………………………………（1）
式中：
T——樣品中蠟樣芽胞桿菌菌落數(shù)；
A——某一稀釋度蠟樣芽胞桿菌典型菌落的總數(shù)；
B——鑒定結(jié)果為蠟樣芽胞桿菌的菌落數(shù)；
C——用于蠟樣芽胞桿菌鑒定的菌落數(shù)；
d ——稀釋因子。
4.4.2.2 菌落計算公式（2）
…………………………………………………（2）
式中：
T ——樣品中蠟樣芽胞桿菌菌落數(shù)；
A 1 ——第一稀釋度（低稀釋倍數(shù)）蠟樣芽胞桿菌典型菌落的總數(shù)；
A 2 ——第二稀釋度（高稀釋倍數(shù)）蠟樣芽胞桿菌典型菌落的總數(shù)；
B 1 ——第一稀釋度（低稀釋倍數(shù)）鑒定結(jié)果為蠟樣芽胞桿菌的菌落數(shù)；
B 2 ——第二稀釋度（高稀釋倍數(shù)）鑒定結(jié)果為蠟樣芽胞桿菌的菌落數(shù)；
C 1 ——第一稀釋度（低稀釋倍數(shù)）用于蠟樣芽胞桿菌鑒定的菌落數(shù)；
C 2 ——第二稀釋度（高稀釋倍數(shù)）用于蠟樣芽胞桿菌鑒定的菌落數(shù)；
1.1——計算系數(shù)（如果第二稀釋度蠟樣芽胞桿菌鑒定結(jié)果為 0，計算系數(shù)采用 1）；
d ——稀釋因子（第一稀釋度）。
4.5 結(jié)果與報告
4.5.1 根據(jù) MYP 平板上蠟樣芽胞桿菌的典型菌落數(shù)，按 4.4 中公式（1）、公式（2）計算，報告每 g（mL）
樣品中蠟樣芽胞桿菌菌數(shù)，以 CFU/g（mL）表示；如 T 值為 0，則以小于 1 乘以最低稀釋倍數(shù)報告。
4.5.2 必要時報告蠟樣芽胞桿菌生化分型結(jié)果。
5 蠟樣芽胞桿菌 MPN 計數(shù)法（第二法）
5.1 檢驗程序
蠟樣芽胞桿菌 MPN 計數(shù)法檢驗程序見圖 2。
.1d 1
2
2 2
1
1 1
C
B A
C
B A
T


GB 4789.14—2014
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圖 2 蠟樣芽胞桿菌 MPN 計數(shù)法檢驗程序
5.2 操作步驟
5.2.1 樣品處理
同 4.2.1。
5.2.2 樣品制備
同 4.2.2。
5.2.3 樣品的稀釋
同 4.2.3。
5.2.4 樣品接種
10 倍系列稀釋
選取 3 個適宜連續(xù)稀釋度的樣品勻液，各吸取 1mL，分別接種于
3 管胰酪胨大豆多黏菌素肉湯
接種 MYP 瓊脂平板
確定鑒定
查 MPN 表
檢樣
25 g(或 25mL)樣品+225 mL 稀釋液，均質(zhì)
報告結(jié)果
30 ℃±1 ℃ 24 h～48 h
30 ℃±1 ℃ 48 h±2 h
GB 4789.14—2014
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取 3 個適宜連續(xù)稀釋度的樣品勻液（液體樣品可包括原液），接種于 10 mL 胰酪胨大豆多黏菌素肉
湯中，每一稀釋度接種 3 管，每管接種 1 mL（如果接種量需要超過 1 mL，則用雙料胰酪胨大豆多黏菌
素肉湯）。于 30 ℃±1 ℃培養(yǎng) 48 h±2 h。
5.2.5 培養(yǎng)
用接種環(huán)從各管中分別移取 1 環(huán)，劃線接種到 MYP 瓊脂平板上，30 ℃±1 ℃培養(yǎng) 24 h±2 h。如果菌
落不典型，可繼續(xù)培養(yǎng) 24 h±2 h 再觀察。
5.2.6 確定鑒定
從每個平板選取 5 個典型菌落（小于 5 個全選），劃線接種于營養(yǎng)瓊脂平板做純培養(yǎng)，30 ℃±1 ℃培
養(yǎng) 24 h±2 h，進(jìn)行確證實驗，見 4.3。
5.3 結(jié)果與報告
根據(jù)證實為蠟樣芽胞桿菌陽性的試管管數(shù)，查 MPN 檢索表（見附錄 B），報告每 g（mL）樣品中
蠟樣芽胞桿菌的最可能數(shù)，以 MPN/g（mL）表示。
GB 4789.14—2014
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附錄 A
培養(yǎng)基和試劑
A.1 磷酸鹽緩沖液（PBS）
A.1.1 成分
磷酸二氫鉀  34.0 g
蒸餾水  500.0 mL
A.1.2 制法
貯存液：稱取 34.0 g 的磷酸二氫鉀溶于 500 mL 蒸餾水中，用大約 175 mL 的 1mol/L 氫氧化鈉溶液
調(diào)節(jié) pH 至 7.2，用蒸餾水稀釋至 1000 mL 后貯存于冰箱。
稀釋液：取貯存液 1.25 mL，用蒸餾水稀釋至 1 000 mL，分裝于適宜容器中，121 ℃高壓滅菌 15 min。
A.2 甘露醇卵黃多黏菌素(MYP)瓊脂
A.2.1 成分
蛋白胨  10.0 g
牛肉粉  1.0 g
D-甘露醇  10.0 g
氯化鈉  10.0 g
瓊脂粉  12.0～15.0 g
0.2 %酚紅溶液  13.0 mL
50 %卵黃液  50.0 mL
多黏菌素B  100,000 IU
蒸餾水  950.0 mL
A.2.2 制法
將 A.2.1 前五種成分加入于 950 mL 蒸餾水中，加熱溶解，校正 pH 至 7.3±0.1，加入酚紅溶液。分裝，
每瓶 95 mL，121 ℃高壓滅菌 15 min。臨用時加熱溶化瓊脂，冷卻至 50 ℃，每瓶加入 50%卵黃液 5 mL
和濃度為 10000 IU 的多黏菌素 B 溶液 1 mL，混勻后傾注平板。
A.2.2.1 50 ％卵黃液
取鮮雞蛋，用硬刷將蛋殼徹底洗凈，瀝干，于 70%酒精溶液中浸泡 30 min。用無菌操作取出卵黃，
加入等量滅菌生理鹽水，混勻后備用。
A.2.2.2 多黏菌素 B 溶液
在 50 mL 滅菌蒸餾水中溶解 500 000 IU 的無菌硫酸鹽多黏菌素 B。
A.3 胰酪胨大豆多黏菌素肉湯
GB 4789.14—2014
10
A.3.1 成分
胰酪胨（或酪蛋白胨）  17.0g
植物蛋白胨（或大豆蛋白胨）  3.0 g
氯化鈉  5.0 g
無水磷酸氫二鉀  2.5 g
葡萄糖  2.5 g
多黏菌素B  100 IU/mL
蒸餾水  1 000.0 mL
A.3.2 制法
將 A.3.1 前五種成分加入于蒸餾水中，加熱溶解，校正 pH 至 7.3±0.2，121 ℃高壓滅菌 15 min。臨
用時加入多黏菌素 B 溶液混勻即可。多黏菌素 B 溶液制法同附錄 A.2.2.2。
A.4 營養(yǎng)瓊脂
A.4.1 成分
蛋白胨  10.0 g
牛肉膏  5.0 g
氯化鈉  5.0 g
瓊脂粉  12.0～15.0 g
蒸餾水  1 000.0 mL
A.4.2 制法
將 A.4.1 所述成分溶解于蒸餾水內(nèi)，校正 pH 至 7.2±0.2，加熱使瓊脂溶化。121℃高壓滅菌 15 min，
備用。
A.5 過氧化氫溶液
A.5.1 試劑
3%過氧化氫溶液：臨用時配制，用 H 2 O 2 配制。
A.5.2 試驗方法
用細(xì)玻璃棒或一次性接種針挑取單個菌落, 置于潔凈試管內(nèi)，滴加 3%過氧化氫溶液 2 mL，觀察結(jié)
果。
A.5.3 結(jié)果
于 30s 內(nèi)發(fā)生氣泡者為陽性，不發(fā)生氣泡者為陰性。
A.6 動力培養(yǎng)基
A.6.1 成分
胰酪胨（或酪蛋白胨）  10.0 g
GB 4789.14—2014
11
酵母粉  2.5 g
葡萄糖  5.0 g
無水磷酸氫二鈉  2.5 g
瓊脂粉  3.0 ～5.0g
蒸餾水  1 000.0 mL
A.6.2 制法
將 A.6.1 所述成分于蒸餾水，校正 pH 至 7.2±0.2，加熱溶解。分裝每管 2 mL～3 mL。115 ℃高壓滅
菌 20 min，備用。
A.6.3 試驗方法
用接種針挑取培養(yǎng)物穿刺接種于動力培養(yǎng)基中，30 ℃±1 ℃培養(yǎng) 48 h±2 h。蠟樣芽胞桿菌應(yīng)沿穿刺
線呈擴散生長，而蕈狀芽胞桿菌常常呈絨毛狀生長，形成蜂巢狀擴散。動力試驗也可用懸滴法檢查。蠟
樣芽胞桿菌和蘇云金芽胞桿菌通常運動極為活潑，而炭疽桿菌則不運動。
A.7 硝酸鹽肉湯
A.7.1 成分
蛋白胨  5.0 g
硝酸鉀  0.2 g
蒸餾水  1 000.0 mL
A.7.2 制法
將 A.7.1 所述成分溶解于蒸餾水。校正 pH 至 7.4，分裝每管 5 mL，121 ℃高壓滅菌 15 min。
A.7.3 硝酸鹽還原試劑
甲液：將對氨基苯磺酸 0.8 g 溶解于 2.5 mol/L 乙酸溶液 100 mL 中。
乙液：將甲萘胺 0.5 g 溶解于 2.5 mol/L 乙酸溶液 100 mL 中。
A.7.4 試驗方法
接種后在 36 ℃±1 ℃培養(yǎng) 24 h～72 h。加甲液和乙液各 1 滴，觀察結(jié)果，陽性反應(yīng)立即或數(shù)分鐘內(nèi)
顯紅色。如為陰性，可再加入鋅粉少許，如出現(xiàn)紅色，表示硝酸鹽未被還原，為陰性。反之，則表示硝
酸鹽已被還原，為陽性。
A.8 酪蛋白瓊脂
A.8.1 成分
酪蛋白  10.0 g
牛肉粉  3.0 g
無水磷酸氫二鈉  2.0 g
氯化鈉  5.0 g
瓊脂粉  12.0～15.0 g
GB 4789.14—2014
12
蒸餾水  1 000.0 mL
0.4 %溴麝香草酚藍(lán)溶液  12.5 mL
A.8.2 制法
除溴麝香草酚藍(lán)溶液外，將 A.8.1 所述各成分溶于蒸餾水中加熱溶解（酪蛋白不會溶解）。校正 pH
至 7.4±0.2，加入溴麝香草酚藍(lán)溶液，121 ℃高壓滅菌 15 min 后傾注平板。
A.8.3 試驗方法
用接種環(huán)挑取可疑菌落，點種于酪蛋白瓊脂培養(yǎng)基上，36 ℃±1 ℃培養(yǎng) 48 h±2 h，陽性反應(yīng)菌落
周圍培養(yǎng)基應(yīng)出現(xiàn)澄清透明區(qū)(表示產(chǎn)生酪蛋白酶)。陰性反應(yīng)時應(yīng)繼續(xù)培養(yǎng) 72 h 再觀察。
A.9 硫酸錳營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基
A.9.1 成分
胰蛋白胨  5.0 g
葡萄糖  5.0 g
酵母浸膏  5.0 g
磷酸氫二鉀  4.0 g
3.08%硫酸錳（MnSO 4 ·H 2 O）  1.0 mL
瓊脂粉  12.0～15.0 g
蒸餾水  1 000.0 mL
A.9.2 制法
將 A.9.1 所述成分溶解于蒸餾水。校正 pH 至 7.2±0.2。121 ℃高壓滅菌 15 min，備用。
A.10 0.5 % 堿性復(fù)紅
A.10.1 成分
堿性復(fù)紅 0.5 g
乙醇 20.0 mL
蒸餾水 80.0 mL
A.10.2 制法
取堿性復(fù)紅 0.5 g 溶解于 20 mL 乙醇中，再用蒸餾水稀釋至 100 mL ，濾紙過濾后儲存?zhèn)溆谩?br /> A.11 動力培養(yǎng)基
A.11.1 成分
蛋白胨 10.0 g
牛肉浸粉 3.0 g
瓊脂 4.0 g
GB 4789.14—2014
13
氯化鈉 5.0 g
蒸餾水  1 000.0 mL
A.11.2 制法
將 A.11.1 所述成分溶解于蒸餾水。校正 pH 至 7.2±0.2，分裝小試管，121 ℃高壓滅菌 15 min，備
用。
A.12 糖發(fā)酵管
A.12.1 成分
牛肉粉  5.0 g
蛋白胨  10.0 g
氯化鈉  3.0 g
磷酸氫二鈉（Na 2 HPO 4 ·12H 2 O）  2.0 g
0.2 %溴麝香草酚藍(lán)溶液  12.0 mL
蒸餾水  1 000.0 mL
A.12.2 制法
A.12.2.1 糖發(fā)酵管按A.12.1所述成分配好后，校正pH至7.2±0.2，按0.5 %加入葡萄糖，分裝于一個有倒
置小管的小試管內(nèi)，115 ℃高壓滅菌15 min。
A.12.2.2 其他各種糖發(fā)酵管可按A.12.1所述成分配好后，分裝每瓶100 mL，115 ℃高壓滅菌15 min。另
將各種糖類分別配好10 %溶液，同時115℃高壓滅菌15 min。將5 mL糖溶液加入于100 mL培養(yǎng)基內(nèi)，以
無菌操作分裝小試管。
注：蔗糖不純，加熱后會自行水解者，應(yīng)采用過濾法除菌。
A.12.3 試驗方法
挑取可疑菌落接種于葡萄糖發(fā)酵管中，厭氧條件下36 ℃±1 ℃培養(yǎng)24 h±2 h。培養(yǎng)基由紅色變?yōu)辄S
色者表明該菌在厭氧條件下能發(fā)酵葡萄糖。
A.13 V-P培養(yǎng)基
A.13.1 成分
磷酸氫二鉀  5.0 g
蛋白胨  7.0 g
葡萄糖  5.0 g
氯化鈉  5.0 g
蒸餾水  1 000.0 mL
A.13.2 制法
將 A.13.1 所述成分溶解于蒸餾水。校正 pH 至 7.0±0.2，分裝每管 1 mL。115 ℃高壓滅菌 20 min，
備用。
A.13.3 試驗方法
GB 4789.14—2014
14
用營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)物接種于本培養(yǎng)基中，36 ℃±1 ℃培養(yǎng) 48 h～72 h。加入 6 %α-萘酚-乙醇溶液 0.5 mL
和 40 %氫氧化鉀溶液 0.2 mL，充分振搖試管，觀察結(jié)果，陽性反應(yīng)立即或于數(shù)分鐘內(nèi)出現(xiàn)紅色。如為陰
性，應(yīng)放在 36 ℃±1 ℃培養(yǎng) 4 h 再觀察。
A.14 胰酪胨大豆羊血(TSSB)瓊脂
A.14.1 成分
胰酪胨（或酪蛋白胨）  15.0 g
植物蛋白胨（或大豆蛋白胨）  5.0 g
氯化鈉  5.0 g
無水磷酸氫二鉀  2.5 g
葡萄糖  2.5 g
瓊脂粉  12.0～15.0 g
蒸餾水  1 000.0 mL
A.14.2 制法
將 A.14.1 所述各成分于蒸餾水中加熱溶解。校正 pH 至 7.2±0.2，分裝每瓶 100 mL。121 ℃高壓滅
菌 15 min。水浴中冷卻至 45 ℃～50 ℃，毎 100 mL 加入 5～10 mL 無菌脫纖維羊血，混勻后傾注平板。
A.15 溶菌酶營養(yǎng)肉湯
A.15.1 成分
牛肉粉  3.0 g
蛋白胨  5.0 g
蒸餾水  990.0 mL
0.1%溶菌酶溶液  10.0 mL
A.15.2 制法
除溶菌酶溶液外，將 A.15.1 所述成分溶解于蒸餾水。校正 pH 至 6.8±0.1，分裝每瓶 99 mL。121 ℃
高壓滅菌 15 min。每瓶加入 0.1 %溶菌酶溶液 1 mL，混勻后分裝滅菌試管，每管 2.5 mL。0.1%溶菌酶溶
液配制：在65 mL滅菌的0.1 mol/L鹽酸中加入0.1 g溶菌酶，隔水煮沸20 min溶解后，再用滅菌的0.1 mol/L
鹽酸稀釋至 100 mL�；蛘叻Q取 0.1 g 溶菌酶溶于 100 mL 的無菌蒸餾水后，用孔徑為 0.45 μm 硝酸纖維
膜過濾。使用前測試是否無菌。
A.15.3 試驗方法
用接種環(huán)取純菌懸液一環(huán)，接種于溶菌酶肉湯中，36 ℃±1 ℃培養(yǎng) 24 h。蠟樣芽胞桿菌在本培養(yǎng)基
(含 0.001 ％溶菌酶)中能生長。如出現(xiàn)陰性反應(yīng)，應(yīng)繼續(xù)培養(yǎng) 24 h。
A.16 西蒙氏檸檬酸鹽培養(yǎng)基
A.16.1 成分
氯化鈉  5.0 g
GB 4789.14—2014
15
硫酸鎂（MgSO 4 ·7 H 2 O）  0.2 g
磷酸二氫氨  1.0 g
磷酸氫二鉀  1.0 g
檸檬酸鈉  1.0 g
瓊脂粉  12.0～15.0 g
蒸餾水  1 000.0 mL
0.2 %溴麝香草酚藍(lán)溶液  40.0 mL
A.16.2 制法
除溴麝香草酚藍(lán)溶液和瓊脂外，將 A.16.1 所述各成分溶解于 1000.0 mL 蒸餾水內(nèi)，校正 pH 至 6.8，
再加瓊脂，加熱溶化。然后加入溴麝香草酚藍(lán)溶液，混合均勻后分裝試管，121 ℃高壓滅菌 15 min。制
成斜面。
A.16.3 試驗方法
挑取少量瓊脂培養(yǎng)物接種于西蒙氏檸檬酸培養(yǎng)基，36 ℃±1 ℃培養(yǎng) 4d。每天觀察結(jié)果，陽性者斜面
上有菌落生長，培養(yǎng)基從綠色轉(zhuǎn)為藍(lán)色。
A.17 明膠培養(yǎng)基
A.17.1 成分
蛋白胨 5.0 g
牛肉粉 3.0 g
明膠 120.0 g
蒸餾水 1 000.0 mL
A.17.2 制法
將 A.17.1 所述成分混合，置流動蒸汽滅菌器內(nèi)，加熱溶解，校正 pH 至 7.4～7.6，過濾。分裝試管，
121 ℃高壓滅菌 10 min，備用。
A.17.3 試驗方法
挑取可疑菌落接種于明膠培養(yǎng)基，36 ℃±1 ℃培養(yǎng) 24 h±2 h，取出，2 ℃～8 ℃放置 30 min，取
出，觀察明膠液化情況。
GB 4789.14—2014
16
附錄B
蠟樣芽胞桿菌最可能數(shù)（MPN）檢索表
每g(mL)檢樣中蠟樣芽胞桿菌最可能數(shù)（MPN）的檢索見表B.1。
表B.1 蠟樣芽胞桿菌最可能數(shù)（MPN）檢索表
陽性管數(shù)
MPN
95%置信區(qū)間  陽性管數(shù)
MPN
95%置信區(qū)間
0.10  0.01  0.001  下限  上限  0.10  0.01  0.001  下限  上限
0  0  0  <3.0  —  9.5  2  2  0  21  4.5  42
0  0  1  3.0  0.15  9.6  2  2  1  28  8.7  94
0  1  0  3.0  0.15  11  2  2  2  35  8.7  94
0  1  1  6.1  1.2  18  2  3  0  29  8.7  94
0  2  0  6.2  1.2  18  2  3  1  36  8.7  94
0  3  0  9.4  3.6  38  3  0  0  23  4.6  94
1  0  0  3.6  0.17  18  3  0  1  38  8.7  110
1  0  1  7.2  1.3  18  3  0  2  64  17  180
1  0  2  11  3.6  38  3  1  0  43  9  180
1  1  0  7.4  1.3  20  3  1  1  75  17  200
1  1  1  11  3.6  38  3  1  2  120  37  420
1  2  0  11  3.6  42  3  1  3  160  40  420
1  2  1  15  4.5  42  3  2  0  93  18  420
1  3  0  16  4.5  42  3  2  1  150  37  420
2  0  0  9.2  1.4  38  3  2  2  210  40  430
2  0  1  14  3.6  42  3  2  3  290  90  1,000
2  0  2  20  4.5  42  3  3  0  240  42  1,000
2  1  0  15  3.7  42  3  3  1  460  90  2,000
2  1  1  20  4.5  42  3  3  2  1100  180  4,100
2  1  2  27  8.7  94  3  3  3  >1100  420  —
注 1：本表采用 3 個稀釋度[0.1 g（mL）、0.01 g（mL）和 0.001 g（mL）]、每個稀釋度接種 3 管。
注 2：表內(nèi)所列檢樣量如改用 l g（mL）、0.1 g（mL）和 0.01 g（mL）時，表內(nèi)數(shù)字應(yīng)相應(yīng)降低 10 倍；如改用 0.01 g（mL）、
0.001 g（mL）、0.0001 g（mL）時，則表內(nèi)數(shù)字應(yīng)相應(yīng)增高 10 倍，其余類推。