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科學(xué)家成功實(shí)現(xiàn)活細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序
作者：陳萬澤等 來源：《自然》
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活細(xì)胞測序記錄細(xì)胞的變化示意圖 來源：Duygu Koldere Vilain
在我們呱呱墜地之前，受精卵是如何發(fā)育成復(fù)雜個體的？為何正常的細(xì)胞會慢慢變成癌細(xì)胞？
細(xì)胞是生命的基本單位，了解它的過去、現(xiàn)在和未來不僅有助于我們了解正常發(fā)育的過程，也對理解疾病的產(chǎn)生和發(fā)展至關(guān)重要。然而，想要“看清”細(xì)胞的“前世今生”仍然存在顯著的技術(shù)困難。
8月17日，現(xiàn)任中國科學(xué)院深圳先進(jìn)技術(shù)研究院合成生物學(xué)研究所研究員（原瑞士洛桑聯(lián)邦理工學(xué)院博士后）陳萬澤以共同第一作者身份在國際頂級期刊Nature上發(fā)表長文，介紹了研究團(tuán)隊(duì)在國際首創(chuàng)的活細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)（Live-seq），該技術(shù)首次讓單細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)錄測序后，依然能保持細(xì)胞存活，首次實(shí)現(xiàn)了活細(xì)胞全基因表達(dá)的連續(xù)觀測。
“該研究實(shí)現(xiàn)了使用Live-seq技術(shù)對同一個活細(xì)胞多次分離部分細(xì)胞質(zhì)進(jìn)行多次轉(zhuǎn)錄組測序的可行性，表明這一技術(shù)有望在將來用于構(gòu)建單個活細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組系列變化動態(tài)。該研究為單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序提供了全新的研究策略，為我們理解生命過程的動態(tài)變化提供了強(qiáng)有力的手段，是這一領(lǐng)域的又一重大突破。” 北京大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院教授湯富酬評論道。
不殺死細(xì)胞就能測序
人類體內(nèi)的細(xì)胞擁有幾乎一樣的基因組，但是為什么能夠產(chǎn)生多種多樣的細(xì)胞？基因組中數(shù)萬個的基因表達(dá)與否和高低，很大程度上決定了細(xì)胞的種類和功能，比如神經(jīng)細(xì)胞、免疫細(xì)胞、各種腫瘤細(xì)胞等等。
因此，如果知道細(xì)胞不同時間的基因表達(dá)的變化，就能夠了解細(xì)胞的過去、現(xiàn)在和未來。
當(dāng)前，單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)是了解細(xì)胞狀態(tài)的重要手段，就像看一張“高清照片”，通過單細(xì)胞測序能夠看清細(xì)胞現(xiàn)在所有基因的表達(dá)狀態(tài)。但是這些技術(shù)在理解細(xì)胞狀態(tài)“電影”般的動態(tài)變化上卻有很大的挑戰(zhàn)。
“利用單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)來觀測細(xì)胞狀態(tài)的前提，是需要將細(xì)胞裂解，提取其中的RNA來測定每個基因表達(dá)量的高低，但這樣就不能避免地殺死了細(xì)胞�！标惾f澤說道，“使用單細(xì)胞測序技術(shù)，也只能了解到一個細(xì)胞當(dāng)下的狀態(tài)，卻不能獲得它的過去，也無法知曉它將來的功能�！�
通過近七年的努力，陳萬澤與合作者開發(fā)了活細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)Live-seq，其核心是通過對活細(xì)胞中的部分細(xì)胞質(zhì)進(jìn)行微創(chuàng)提取，并對極其微量的細(xì)胞質(zhì)RNA進(jìn)行擴(kuò)增，實(shí)現(xiàn)在進(jìn)行單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序后，依舊保持細(xì)胞的存活和功能，從而可以跟蹤細(xì)胞的動態(tài)變化。
論文通訊作者、瑞士洛桑聯(lián)邦理工學(xué)院教授Bart Deplancke表示，該技術(shù)兼具全基因表達(dá)分辨率和動態(tài)解析能力，是目前對單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組直接動態(tài)測量、偶聯(lián)細(xì)胞現(xiàn)有狀態(tài)和其后續(xù)表型的唯一解決方案。
兩次碰壁，終于“釣”出RNA
如何在不殺死細(xì)胞的前提下，看到細(xì)胞的動態(tài)變化？
“我們首先想到的是外泌體，它是細(xì)胞向外面吐出來的小泡，里面有蛋白、RNA等物質(zhì)。如果我們把單個細(xì)胞的外泌體都收集起來，再對其中的RNA進(jìn)行測量，或許就可以在一定程度上反映細(xì)胞狀態(tài)而又不殺死細(xì)胞。”陳萬澤說道。
單個細(xì)胞中僅有10 pg（皮克）的RNA，這相當(dāng)于一克的一千億分之一的重量，而細(xì)胞分泌的外泌體中的RNA更是少之又少。研究團(tuán)隊(duì)設(shè)計(jì)了微流控芯片來完成單細(xì)胞捕獲、外泌體收集等過程，發(fā)現(xiàn)由于外泌體中的RNA數(shù)量太少，根本無法實(shí)現(xiàn)單細(xì)胞分子水平的觀測。
隨后，陳萬澤嘗試?yán)�用在生命科學(xué)領(lǐng)域非常小眾的原子力顯微鏡，它有一個很尖的硅探針，多用來檢測物質(zhì)表面性質(zhì)。研究團(tuán)隊(duì)通過對探針進(jìn)行表面活化、修飾、洗脫等改造后，讓其能夠把細(xì)胞中的RNA“釣”出來。
“這種探針很細(xì)，對細(xì)胞的損傷很小，就像‘魚鉤’一樣，改造后可以把細(xì)胞中的RNA‘釣’出來，又能保證細(xì)胞繼續(xù)存活。我們改造了數(shù)十個探針后，結(jié)果只在兩個細(xì)胞上成功“釣”到了基因�！标惾f澤回憶道，當(dāng)時購買一個原子力顯微鏡探針需要800美元，研究成本太高，成功率太低，讓這項(xiàng)研究再次面臨阻礙。
瑞士洛桑聯(lián)邦理工學(xué)院學(xué)科交叉氛圍濃厚，在一次偶然的學(xué)術(shù)交流中，陳萬澤與導(dǎo)師了解到，瑞士蘇黎世聯(lián)邦理工學(xué)院的Julia Vorholt實(shí)驗(yàn)室開發(fā)了一種特殊的原子力顯微鏡，能夠吸出一部分的細(xì)胞質(zhì)。
一番交流后，兩個課題組一拍即合，展開了聯(lián)合攻關(guān)。聯(lián)合團(tuán)隊(duì)對一系列的實(shí)驗(yàn)過程進(jìn)行了優(yōu)化，包括解決了RNA降解、低溫下的快速操作、超微量樣品轉(zhuǎn)移、采樣通道清洗避免交叉污染、圖像下追蹤細(xì)胞等多種問題，以保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性。
聯(lián)合團(tuán)隊(duì)利用重新改造后的Live-seq，對五種類型共295個細(xì)胞進(jìn)行了測序，發(fā)現(xiàn)Live-seq能夠有效區(qū)分不同類型的細(xì)胞，且平均每個細(xì)胞能檢測到約4112個基因的表達(dá)信息。
僅對少量的細(xì)胞質(zhì)進(jìn)行測序，是否就能代表細(xì)胞的狀態(tài)？
“我們平行比較了單細(xì)胞測序結(jié)果，發(fā)現(xiàn)活細(xì)胞測序結(jié)果與普通的單細(xì)胞測序結(jié)果高度吻合，證明Live-seq能夠很好地體現(xiàn)細(xì)胞的全轉(zhuǎn)錄組狀態(tài)�！标惾f澤說道。
細(xì)胞的存活率又如何保證呢？
“原子力探針尖端只有幾百個納米大小，而且能和細(xì)胞膜密封，對細(xì)胞損傷極小。吸取約5%至50%的細(xì)胞質(zhì)后，細(xì)胞體積可以快速恢復(fù)到正常水平，存活率在85%至89%之間，細(xì)胞能進(jìn)行正常分裂。通過一系列的功能分析和分子表征，我們沒有發(fā)現(xiàn)Live-seq對細(xì)胞的狀態(tài)有顯著的影響�！标惾f澤表示。
對此，審稿人在評審意見中也寫道：“由于細(xì)胞測序后仍舊存活，Live-seq首次實(shí)現(xiàn)對同一個細(xì)胞全基因表達(dá)的連續(xù)測量�！�
細(xì)胞測序史從“高清圖片”到“高清電影”的跨越
在細(xì)胞觀測技術(shù)史上，顯微成像和基因編輯介導(dǎo)的分子記錄等技術(shù)不僅能觀察細(xì)胞水平的生長、分裂、死亡等過程，還能觀測細(xì)胞中的單個或幾個基因指標(biāo)。
2009年，單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)為更系統(tǒng)全面地定義細(xì)胞類型和狀態(tài)提供了變革性手段。但人們?nèi)匀恢荒苡^察到細(xì)胞的靜態(tài)狀態(tài)，無法連續(xù)觀測細(xì)胞的動態(tài)或者檢查細(xì)胞后續(xù)的表型。
如果將利用單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)觀測細(xì)胞比喻為看一張細(xì)胞在分子水平的高清圖片，那么利用Live-seq觀測細(xì)胞，就好比看一部高清電影，能夠看見細(xì)胞的“前世今生”。
“Live-seq可以回答細(xì)胞怎樣的過去決定了它的現(xiàn)在，不只知道細(xì)胞中為何存在差異，還知道這些差異從何而來�！标惾f澤介紹道。
在驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)中，研究團(tuán)隊(duì)利用Live-seq直接測定了同一個巨噬細(xì)胞在不同時間的狀態(tài)變化，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞起始狀態(tài)的少數(shù)基因的表達(dá)差異和噪音（如Nfkbia、Gsn等）是決定細(xì)胞后續(xù)反應(yīng)差異的重要原因。對應(yīng)地，普通的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組無法找到這些規(guī)律。
陳萬澤表示，盡管Live-seq仍然存在諸多挑戰(zhàn)，需要進(jìn)一步完善，比如低通量、暫不能在體內(nèi)應(yīng)用、在高度極化且mRNA分布不均的細(xì)胞中無法實(shí)現(xiàn)全細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序、對細(xì)胞更多次的采樣還需進(jìn)一步研究等，但該技術(shù)首次實(shí)現(xiàn)了活細(xì)胞連續(xù)觀測，也為單細(xì)胞測序技術(shù)發(fā)展帶來了更多可能性。未來，團(tuán)隊(duì)將進(jìn)一步進(jìn)行深入研究，提高Live-seq技術(shù)的可用性。（來源：中國科學(xué)報(bào) 刁雯蕙）
相關(guān)論文信息：https://doi.org/10.1038/s41586-022-05046-9