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中 華 人 民 共 和 國(guó) 國(guó) 家 標(biāo) 準(zhǔn)
GB4789. 43 — 2016
食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)
食品微生物學(xué)檢驗(yàn)
微生物源酶制劑抗菌活性的測(cè)定
2016-12-23 發(fā)布 2017-06-23 實(shí)施
中華人民共和國(guó)國(guó)家衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì)
國(guó) 家 食 品 藥 品 監(jiān) 督 管 理 總 局
發(fā) 布
GB4789. 43 — 2016
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食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)
食品微生物學(xué)檢驗(yàn)
微生物源酶制劑抗菌活性的測(cè)定
1  范圍
本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了微生物源酶制劑抗菌活性的測(cè)定方法。
本標(biāo)準(zhǔn)適用于用微生物生產(chǎn)的酶制劑抗菌活性的測(cè)定。
2  設(shè)備和材料
除微生物實(shí)驗(yàn)室常規(guī)滅菌及培養(yǎng)設(shè)備外,其他設(shè)備和材料如下:
2. 1  生物安全柜。
2. 2  冰箱: 2℃~5℃ 。
2. 3  恒溫培養(yǎng)箱: 36℃±1℃ 。
2. 4  恒溫水浴箱: 46℃±1℃ 。
2. 5  天平:感量為 0. 1g 。
2. 6  振蕩器。
2. 7  無菌吸管: 1mL (具 0. 01mL 刻度)、 10mL (具 0. 1mL 刻度)或微量移液器及吸頭。
2. 8  無菌培養(yǎng)皿:直徑 90mm 。
2. 9  無菌錐形瓶:容量 250mL 、 500mL 。
2. 10 pH 計(jì)或精密
pH 試紙。
2. 11  無菌紙片:見 A. 8 。
2. 12  無菌鑷子。
2. 13  游標(biāo)卡尺:刻度為 0. 1mm 。
3  培養(yǎng)基和試劑
3. 1  胰蛋白胨大豆瓊脂( TryptoneSoyAgar , TSA ):見 A. 1 。
3. 2  胰蛋白胨大豆肉湯( TryptoneSoyBroth , TSB ):見 A. 2 。
3. 3  平板計(jì)數(shù)瓊脂( PlateCountAgar ):見 A. 3 。
3. 4 0. 1mol
/ LHCl :見 A.
4 。
3. 5  無菌生理鹽水:見 A. 5 。
3. 6 50. 0 μ g / mL 環(huán)丙沙星( Ciprofloxacin , CIP )溶液:見 A. 6 。
3. 7 5. 0 μ g /片 環(huán)丙沙星紙片:見 A. 7 。
4  試驗(yàn)菌株
4. 1  金黃色葡萄球菌( Staphylococcusaureus ) ATCC6538 。
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4. 2  大腸埃希氏菌( Escherichiacoli ) ATCC11229 。
4. 3  蠟樣芽胞桿菌( Bacilluscereus ) ATCC2 。
4. 4  環(huán)狀芽孢桿菌( Bacilluscirculans ) ATCC4516 。
4. 5  化膿性鏈球菌( Streptococcuspyogenes ) ATCC12344 。
4. 6  粘質(zhì)沙雷菌( Serratiamarcescens ) ATCC14041 。
5  檢驗(yàn)程序
微生物源酶制劑抗菌活性的測(cè)定檢驗(yàn)程序見圖 1 。
圖 1  微生物源酶制劑抗菌活性的測(cè)定檢驗(yàn)程序
6  操作步驟
6. 1  試驗(yàn)菌懸液原液制備
將金黃色葡萄球菌( ATCC6538 )、大腸埃希氏菌(
ATCC11229 )、蠟樣芽孢桿菌( ATCC2 )、環(huán)狀芽
孢桿菌( ATCC4516 )、化膿性鏈球菌(
ATCC12344 )、粘質(zhì)沙雷菌( ATCC14041 )凍存菌株分別接種于
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盛有 5mLTSB 的試管,置 36℃±1℃ 培養(yǎng) 18h~24h 進(jìn)行第一次傳代培養(yǎng),分別挑取第一次傳代培
養(yǎng)液 1~2 環(huán)轉(zhuǎn)種于 5mLTSB 肉湯,置 36℃±1℃ 培養(yǎng) 18h~24h 進(jìn)行二次傳代培養(yǎng),作為試驗(yàn)菌懸
液原液備用。
試驗(yàn)菌懸液原液純度檢測(cè):分別挑取試驗(yàn)菌懸液原液各一環(huán),劃線接種于 TSA 平板, 36 ℃±1 ℃
培養(yǎng) 20h~24h ,觀察純度。
6. 2  菌懸液原液濃度測(cè)定
6. 2. 1  菌懸液原液稀釋
分別取 6.
1 中制備的菌懸液原液依次進(jìn)行十倍梯度稀釋,蠟樣芽孢桿菌和環(huán)狀芽孢桿菌分別制成
10
-4 稀釋液,金黃色葡萄球菌、大腸埃希氏菌、化膿性鏈球菌、粘質(zhì)沙雷菌分別制成 10 -5 稀釋液。
6. 2. 2  培養(yǎng)計(jì)數(shù)
分別吸取 6.
2. 1 中制備好的各菌稀釋液 1mL 于無菌平皿內(nèi),每個(gè)稀釋度做兩個(gè)平行,并用無菌生
理鹽水作空白對(duì)照。向平皿中傾注冷卻至 46℃ 左右(可放置于 46℃±1℃ 的恒溫水浴箱中保溫)的平
板計(jì)數(shù)瓊脂 15mL~20mL ,并轉(zhuǎn)動(dòng)平皿使其混合均勻。待瓊脂凝固后,將平板翻轉(zhuǎn),于 36℃±1℃ 培
養(yǎng) 24h 后計(jì)數(shù),各菌懸液原液中菌濃度均大于 10
6 CFU
/ mL 時(shí)方可使用。
6. 3  檢測(cè)平板制備
傾注融化并冷卻至 46℃±1℃ 的 TSA 培養(yǎng)基 15mL 于無菌培養(yǎng)皿內(nèi),待其凝固后制成 TSA 平
板,備用。
將 6.
1 中二次傳代后的各菌培養(yǎng)物分別用冷卻至 46℃±1℃ 的 TSA 培養(yǎng)基按 1∶10 的比例稀釋
(其中化膿性鏈球菌 ATCC12344 按 1∶20 的比例稀釋),充分混勻后各取 10mL 至上述已制備好、于
46℃±1℃ 中保溫的 TSA 平板內(nèi),輕輕搖動(dòng)平板使菌液均勻鋪平,待其凝固后制成檢測(cè)平板,備用。
注:為防止含菌培養(yǎng)基遇到 TSA 后馬上凝固,引起菌懸液鋪板不均勻,菌懸液鋪板前應(yīng)事先將 TSA 平板置于 46℃±
1℃ 條件下保溫平衡 10min 。
6. 4  酶制劑紙片的制備
準(zhǔn)確稱(移)取 1.
0g ( mL )酶制劑于 9mL 無菌生理鹽水中,充分混勻后制成
10% 的酶制劑溶液。
將無菌紙片放入無菌平皿內(nèi),在每張紙片上緩緩滴加 100 μ L10% 的酶制劑溶液,使其全部吸收,每種酶
制劑樣品制備 12 張紙片。
6. 5  貼紙片及培養(yǎng)
將 6.
4 中制備的含待測(cè)酶制劑的紙片、含環(huán)丙沙星的陽(yáng)性對(duì)照紙片(見 A. 7 )和含 100 μ L 無菌生理
鹽水的空白陰性對(duì)照紙片用無菌鑷子分別置 6.
3 中制備的檢測(cè)平板上,每個(gè)平板貼 2 張紙片( 2 張含待
測(cè)酶制劑的紙片或 2 張含環(huán)丙沙星的紙片或 2 張空白紙片),兩紙片圓點(diǎn)的間距大于 32mm ,每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)
菌株分別設(shè)一陽(yáng)性對(duì)照和一陰性對(duì)照平板。將平板正置于 4℃±0.
5℃ 冰箱內(nèi)過夜( 12h~16h )。第
二天轉(zhuǎn)入 36℃±1℃ 恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 24h 后,測(cè)定酶制劑樣品、環(huán)丙沙星和陰性對(duì)照紙片形成的抑
菌圈。
7  抗菌活性結(jié)果報(bào)告
7. 1  結(jié)果判定
若待測(cè)酶制劑對(duì) 3 種或 3 種以上受試微生物呈現(xiàn)出抗菌活性,即紙片周圍出現(xiàn)清晰可見的抑菌圈
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(每個(gè)抑菌圈直徑 ≥16mm ),且陽(yáng)性對(duì)照環(huán)丙沙星紙片對(duì)金黃色葡萄球菌、蠟樣芽孢桿菌、粘質(zhì)沙雷菌、
環(huán)狀芽孢桿菌、化膿性鏈球菌 5 種細(xì)菌形成的抑菌圈均 >16mm ,則判定該酶制劑樣品中存在抗菌活性
物質(zhì)。
7. 2  結(jié)果報(bào)告
報(bào)告樣品中檢出抗菌活性或未檢出抗菌活性。
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附 錄 A
培養(yǎng)基與試劑
A. 1  胰蛋白胨大豆瓊脂( TryptoneSoyAgar , TSA )
A. 1. 1  成分
胰蛋白胨 15.
0g
大豆蛋白胨
5. 0g
氯化鈉
5. 0g
瓊脂粉
15. 0g
蒸餾水
1000mL
A. 1. 2  制法
將上述各成分加于蒸餾水中,煮沸溶解,調(diào)節(jié)
pH
至 7.
2±0. 2 ,分裝至錐形瓶中, 121℃ 滅菌 15min 。
A. 2  胰蛋白胨大豆肉湯( TryptoneSoyBroth , TSB )
A. 2. 1  成分
胰蛋白胨
15. 0g
大豆蛋白胨
5. 0g
氯化鈉
5. 0g
蒸餾水
1000mL
A. 2. 2  制法
將上述各成分加于蒸餾水中,煮沸溶解,調(diào)節(jié)
pH
至 7.
2±0. 2 ,分裝試管, 121℃ 滅菌 15min 。
A. 3  平板計(jì)數(shù)瓊脂( PlateCountAgar , PCA )
A. 3. 1  成分
胰蛋白胨
5. 0g
酵母浸膏
2. 5g
葡萄糖
1. 0g
瓊脂
15. 0g
蒸餾水
1000mL
A. 3. 2  制法
上述各成分加于蒸餾水中,煮沸溶解,調(diào)節(jié)
pH
至 7.
2±0. 2 ,分裝至錐形瓶中, 121℃ 滅菌 15min 。
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A. 4 0. 1mol
/ LHCl
A. 4. 1  成分
HCl 9mL
蒸餾水
991mL
A. 4. 2  制法
移取濃鹽酸 9mL (質(zhì)量濃度為 36% ,密度為 1.
17g
/ m
3 ),用無菌蒸餾水稀釋至 1000mL ,
0. 22 μ m
微孔濾膜過濾除菌后備用。
A. 5  無菌生理鹽水
A. 5. 1  成分
氯化鈉
8. 5g
蒸餾水
1000mL
A. 5. 2  制法
稱取 8.
5g 氯化鈉溶于 1000mL
蒸餾水,
121℃ 滅菌 15min 。
A. 6 50. 0μg / mL 環(huán)丙沙星( Ciprofloxacin , CIP )
A. 6. 1  成分
1000 μ g / mL 環(huán)丙沙星 0. 5mL
無菌生理鹽水
9. 5mL
A. 6. 2  制法
按產(chǎn)品說明書(百分比,含水量或效價(jià))稱取一定質(zhì)量的環(huán)丙沙星用適量 0.
1mol
/ LHCl 溶解使其
濃度為 1000 μ g / mL ,無菌條件下 0.
22 μ m 微孔濾膜過濾后移取 0. 5mL ,用無菌生理鹽水稀釋至 10mL ,
混勻。
A. 7 5. 0μg /片環(huán)丙沙星紙片( Ciprofloxacinpaper , CIPpaper )
A. 7. 1  成分
50. 0 μ g / mL 環(huán)丙沙星 100 μ L
無菌紙片
1 張
A. 7. 2  制法
吸取 50.
0 μ g / mL 環(huán)丙沙星溶液 100 μ L 緩慢均勻滴加于無菌紙片上,制成 5. 0 μ g /片環(huán)丙沙星
紙片。
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A. 8  無菌紙片
A. 8. 1  要求
紙片外觀應(yīng)整潔、無毛邊,無明顯變形,無破損,
pH
為中性,厚度 0.
3mm~0. 6mm , 60s 內(nèi)吸收 100 μ L
蒸餾水。
A. 8. 2  制備及儲(chǔ)存方法
制成標(biāo)準(zhǔn)直徑為 13.
0mm±0. 1mm 的圓形紙片,置玻璃容器內(nèi),密封, 121 ℃ 滅菌 15min 后,
80℃±5℃ 干燥 4h ,備用。