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中華人民共和國國家標準
GB 4789.31—2013
食品安全國家標準
食品微生物學檢驗
沙門氏菌、志賀氏菌和致瀉大腸埃希氏菌
的腸桿菌科噬菌體診斷檢驗
2013-11-29 發(fā)布  2014-06-01 實施
GB 4789.31—2013
I
前 言
本標準代替 GB/T 4789.31-2003《食品衛(wèi)生微生物學檢驗 沙門氏菌、志賀氏菌和致瀉大腸埃希氏菌
的腸桿菌科噬菌體檢驗方法》。
本標準與 GB/T 4789.31-2003 相比, 主要變化如下：
——修改了操作步驟；
——增加了附錄 B。
GB 4789.31—2013
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食品安全國家標準
食品微生物學檢驗
沙門氏菌、志賀氏菌和致瀉大腸埃希氏菌的
腸桿菌科噬菌體診斷檢驗
1 范圍
本標準規(guī)定了應用腸桿菌科噬菌體診斷方法檢驗食品中沙門氏菌、志賀氏菌和致瀉大腸埃希氏菌。
本標準適用于各類食品和食源性疾病事件樣品中沙門氏菌、志賀氏菌和致瀉大腸埃希氏菌的檢驗。
本標準適用于食品行業(yè)從業(yè)人員腸道沙門氏菌和志賀氏菌帶菌檢驗。
2 設備和材料
除微生物實驗室常規(guī)滅菌、培養(yǎng)的設備外，其他設備和材料如下：
a)  恒溫培養(yǎng)箱：36 ℃±1 ℃, 42 ℃±1 ℃，50 ℃±1 ℃;
b)  厭氧培養(yǎng)裝置：41.5 ℃±0.5 ℃;
c)  顯微鏡：10 倍～100 倍;
d)  水平儀：噬菌體試驗的工作臺面應調(diào)整至水平位置;
e)  已滅菌 1 mL 一次性注射器（應為塑料材質(zhì)），針頭無編號，使用前測定每滴 5 L~10 L（每
mL 有 100~200 滴）可用;
f)  微量移液器及吸頭（10 L 和 5 L）;
g)  定量移液器及吸頭（100 L 和 50 L）;
h)  無菌吸管：10 mL、5 mL、1 mL;
i)  無菌毛細管;
j)  無菌培養(yǎng)皿：90 mm;
k)  無菌棉簽;
l)  帶蓋的滅菌小試管：8 mm×50 mm;
m) 載物玻片。
3 培養(yǎng)基和試劑
3.1 亞硒酸鹽胱氨酸（SC）增菌液：見附錄 A 中的 A.1。
3.2 四硫磺酸鈉煌綠（TTB）增菌液：見附錄 A 中的 A.2。
3.3 志賀氏菌（BCT）增菌液：見附錄 A 中的 A.3。
3.4 營養(yǎng)肉湯（NB）：見附錄 A 中的 A.4。
3.5 營養(yǎng)瓊脂（NA）：見附錄 A 中的 A.5。
3.6 營養(yǎng)半固體瓊脂（NSA）：見附錄 A 中的 A.6。
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3.7 三糖鐵瓊脂（TSI）：見附錄 A 中的 A.7。
3.8 葡萄糖銨瓊脂：見附錄 A 中的 A.8。
3.9 腸桿菌科診斷用噬菌體，7 種和 3 種。必要時可再購置大腸埃希氏菌分型噬菌體（6 種）一套。安
瓿開啟后用無菌毛細管吸出移入滅菌小試管內(nèi)，如果每次使用量很少，可分裝于 2~3 支試管內(nèi)，保存于
5 ℃冰箱備用。
3.10 沙門氏菌因子血清，志賀氏菌分型因子血清，致瀉大腸埃希氏菌分型因子血清。因子血清的種類
視需要而定。
4 檢驗程序
4.1 沙門氏菌的檢驗程序
沙門氏菌的檢驗程序見圖 1。
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圖 1 沙門氏菌的檢驗程序
4.2 志賀氏菌的檢驗程序
志賀氏菌的檢驗程序見圖 2。
ONPG  甘露醇、山梨醇
檢 樣
O-1 裂解
其他均不裂解
非如左述的
各種反應結(jié)果
沙門氏菌
血清學試驗證實
非沙門氏菌  沙門氏菌
血清學試驗證實
沙門氏菌
血清學試驗證實
非沙門氏菌  非沙門氏菌
報 告
前增菌、增菌和分離
挑取可疑菌落
TSI(斜面、底面、產(chǎn)氣、H 2 S)
蛋白胨水（靛基質(zhì)）
尿素（pH7.2）,KCN,賴氨酸
H 2 S+,靛基質(zhì)－，
尿素－，KCN－，
賴氨酸＋
噬菌體試驗
H 2 S+，靛基質(zhì)+，
尿素－，KCN－，
賴氨酸+
各種噬菌體
均不裂解
非如左述的
各種裂解結(jié)果
H 2 S－，靛基質(zhì)－，
尿素－，KCN－，
賴氨酸+/－
＋,＋, －  －,－ +
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圖 2 志賀氏菌的檢驗程序
Sh 裂解，并呈現(xiàn)
各種裂解模式
Sh 不裂解
血清學試驗與裂解模式相符
且被 1 RTD Sh 裂解
血清學試驗與裂模式不相符
或不被 1 RTD Sh 裂解
生化分群試驗
葡萄糖銨試驗
必要時加做乙酸鈉、克氏檸檬酸鹽、
黏液酸、七葉苷、水楊苷試驗
七葉苷\水楊苷試驗
志賀氏菌屬
分群及分型結(jié)果
葡萄糖銨+
或任何其他陽性結(jié)果
非志賀氏菌
報 告
非志賀氏菌
非志賀氏菌
噬菌體試驗
非如左述的各
種反應結(jié)果
檢 樣
挑取可疑菌落
TSI，葡萄糖半固體
增菌和分離
TSI 底層產(chǎn)酸,斜面產(chǎn)堿，H 2 S－
不產(chǎn)氣，無動力
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4.3 致瀉大腸埃希氏菌的檢驗程序
致瀉大腸埃希氏菌的檢驗程序見圖 3。
圖 3 致瀉大腸埃希氏菌的檢驗程序
檢 樣
E 和或 Sh、E－4
噬菌體不裂解
其他噬菌體裂解
不同來源分離的菌株
其裂解模式具有同一性
TSI，靛基質(zhì)，
pH7.2 尿素，KCN,
賴氨酸，動力
TSI 底層＋，H 2 S－,
KCN－，尿素－
非如左述
各種反應結(jié)果
血清學試驗
ETEC+
增菌和分離
E 和或 Sh、E－4
噬菌體裂解
各種噬菌體均不裂解
氧化酶－，G－桿菌
EPEC+
產(chǎn)腸毒素
大腸埃希氏菌
非大腸
埃希氏菌
賴氨酸－，靛基質(zhì)+，
動力－(O124 動力+/－)
腸毒素+
EIEC+  非如左述
各種反應結(jié)果
非大腸
埃希氏菌
非致瀉大
腸埃希氏菌
腸道侵襲性
大腸埃希氏菌
腸道致病性
大腸埃希氏菌
乳糖發(fā)酵或不發(fā)酵
的菌落 3~5 個
噬菌體試驗
STEC(O157)
stx1,stx2,hly+
產(chǎn)志賀毒素
大腸埃希氏菌
eae+
報告
GB 4789.31—2013
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5 操作步驟
5.1 前增菌、增菌和分離
5.1.1 沙門氏菌的前增菌、增菌和分離按 GB 4789.4 進行。沙門氏菌增菌液靈敏度的測定見附錄 B。在
食品行業(yè)從業(yè)人員的腸道沙門氏菌帶菌檢驗時，采集的標本應增菌，不應前增菌。食物中毒標本不應前
增菌，所采集的標本同時做增菌和不增菌步驟。
5.1.2 志賀氏菌的增菌和分離按GB 4789.5進行。沒有厭氧培養(yǎng)條件的實驗室可以采用附錄A中的BCT
增菌液。食物中毒患者的糞便標本同時做增菌和不增菌步驟。
5.1.3 致瀉大腸埃希氏菌的增菌和分離按 GB 4789.6 和 GB 4789.36 進行。食物中毒標本同時做增菌和
不增菌步驟。
5.2 噬菌體試驗
5.2.1 培養(yǎng)基的準備
營養(yǎng)瓊脂平板（含瓊脂 1%~1.5%，為防止變形桿菌的蔓延生長，可按 0.02%量加入十二烷基硫酸鈉），
營養(yǎng)瓊脂加熱溶化后，加入每個 9 cm 平皿中約 20 mL~25 mL，放在水平臺面上待其凝固。翻轉(zhuǎn)平板，
在 36 ℃1 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)半開皿倒置約 1 h，或 50 ℃1 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)半開皿倒置約 30 min，以烘干培養(yǎng)基
表面水分。
5.2.2 試驗菌液的準備
5.2.2.1 自選擇性瓊脂平板上分別挑取 2 個以上典型或可疑菌落，檢驗沙門氏菌時，挑取乳糖陰性產(chǎn)
H 2 S 或不產(chǎn) H 2 S 的菌落，和乳糖陽性產(chǎn) H 2 S 的菌落。檢驗大腸埃希氏菌時挑取乳糖陽性或乳糖陰性的菌
落。檢驗志賀氏菌時挑取典型或可疑菌落分別接種 TSI、半固體和營養(yǎng)瓊脂斜面各一管，置 36 ℃1 ℃
培養(yǎng) 20 h～24 h 后選取三糖鐵底層產(chǎn)酸、斜面產(chǎn)堿，不產(chǎn) H 2 S，不產(chǎn)氣無動力的菌落。下述兩種方法可
供制備試驗菌液時選用。
5.2.2.2 方法一：將待檢菌落接種于營養(yǎng)肉湯管內(nèi)，于 36 ℃1 ℃培養(yǎng) 14 h~24 h。挑取此肉湯培養(yǎng)物
1 滿環(huán)（約 5 L），稀釋于盛有 1 mL~2 mL 的營養(yǎng)肉湯管內(nèi)，使成為 1:200~1:400 稀釋菌液，含菌量約為
1×10 6  CFU/mL。
5.2.2.3 方法二：用接種針在鑒別平板上挑取可疑菌落，稀釋于盛有 1mL~2 mL 營養(yǎng)肉湯管內(nèi)，含菌
量約為 1×10 6 CFU/mL。
5.2.3 涂抹試驗菌液
5.2.3.1 斑點涂抹法：將營養(yǎng)瓊脂表面自圓心起分為三等分或二等分，每等分可供涂抹 1 株細菌培養(yǎng)物。
每挑取試驗菌液 1 滿環(huán)，涂抹直徑約 1 cm 的菌斑一個。每株培養(yǎng)物涂抹菌斑 7 個，外圈 5 個，內(nèi)圈 2
個。
5.2.3.2 棉簽涂抹法：用無菌棉簽蘸取試驗菌液并略擠去過多液體，在如上瓊脂平板表面三分之一的區(qū)
域內(nèi)涂抹。三個涂抹區(qū)之間保持適當距離，待菌液干燥。
5.2.4 滴加噬菌體
用定量為 1 mL 的一次性注射器（針頭無編號，1 mL 約有 100~200 滴，每滴相當于 5 L~10 L），
在每一個菌斑上滴加噬菌體�；蛴枚�量�� 10 L 或 5 L 的微量移液器在每一個菌斑上滴加噬菌體一滴，
每滴加一種噬菌體應更換一副注射器或一個吸頭，但是每副注射器或每一個吸頭可以滴完各株細菌的同
一種噬菌體。滴加的噬菌體依次為 O-I、C、Sh、E、CE、E-4 和 Ent。滴加噬菌體時應將瓊脂平板放在
水平臺面上，液滴應懸空滴下，不要污染針頭或滴頭。待 7 種噬菌體均滴加完畢后，略等數(shù)分鐘待噬菌
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體液干燥。翻轉(zhuǎn)平板，放在 36 ℃培養(yǎng) 5 h~6 h，和 14 h~24 h 各觀察一次結(jié)果。
如果僅有少數(shù)幾株細菌作噬菌體試驗，可用直徑為 3 mm 的接種環(huán)挑取噬菌體，每一滿環(huán)相當于 5
L，依次加在菌斑上，盡量減少在室溫放置的時間。
5.2.5 試驗結(jié)果的判定
必要時（例如不能測定到完整的血清型），可吸取少許剩余的蛋白胨水培養(yǎng)物作靛基質(zhì)試驗，大腸埃
希氏菌一般為靛基質(zhì)陽性，沙門氏菌為靛基質(zhì)陰性。噬菌體試驗的結(jié)果見表 1。
表 1 噬菌體試驗結(jié)果
序號
噬菌體裂解模式
判定結(jié)果
O-I  C  Sh  E  CE  E-4  Ent
1  CL  -  -  -  -  -  -  沙門氏菌屬
2  CL  -  -  -  -  CL  -  沙門氏菌屬(靛基質(zhì)-),大腸埃希氏菌(靛基質(zhì)+)
3  -  CL  -  -  (-)  (-)  -  弗勞地氏檸檬酸桿菌群
a
4  -  -  CL  v  v  v  -  志賀氏菌屬
b ,大腸埃希氏菌
5  CL  -  CL  v  v  v  -  大腸埃希氏菌
6  v  -  -  CL  v  v  -  大腸埃希氏菌
7  -  -  -  -  CL  v  -  弗勞地氏檸檬酸桿菌群
a ,大腸埃希氏菌
8  -  -  -  -  -  CL  -  大腸埃希氏菌
9  -  (-)  v  -  -  -  CL  陰溝腸桿菌
0  -  -  -  -  -  -  -  噬菌體不裂解培養(yǎng)物,用生化試驗鑒定
注：CL 表示融合性裂解；– 表示不裂解；（－）表示少量菌株裂解；v 表示裂解或不裂解。
a 含弗勞地氏檸檬酸桿菌、楊氏檸檬酸桿菌、布雷克氏檸檬酸桿菌、沃克曼氏檸檬酸桿菌和吉倫氏檸檬酸桿菌。
b 按表 3 檢索并做血清學分型試驗。
5.2.6 供快速檢驗沙門氏菌的噬菌體簡化診斷法
采用如下 3 種噬菌體：沙門氏菌 O-I 噬菌體；E 多價噬菌體，內(nèi)含 E 和 Sh；C 多價噬菌體，內(nèi)含 C、
CE 和 Ent。培養(yǎng)基和試驗菌液的準備均同前法。
涂抹試驗菌液：斑點涂抹法將瓊脂平板表面分為 4 等分或 6 等分，每等分可供涂抹一株細菌培養(yǎng)物，
每株培養(yǎng)物涂抹 3 個菌斑，外圈 2 個，內(nèi)圈 1 個。棉簽涂抹法可將試驗菌液在瓊脂平板上涂抹成帶狀，
每個平板約可涂抹 5 條菌帶，置數(shù)分鐘，待菌斑干燥。
依次滴加上述 3 種噬菌體。斑點涂抹法，一般可把 O-I 噬菌體滴加在內(nèi)圈的菌斑上。帶狀涂抹法，
可將 O-I 噬菌體滴加在菌帶的左邊。待噬菌體液滴干燥后，翻轉(zhuǎn)平板，在 36 ℃培養(yǎng) 5 h ~6 h，和 14 h ~24
h 各觀察一次結(jié)果。按表 2 判定結(jié)果。
表 2 噬菌體試驗簡化診斷法
O-I  E 多價  C 多價  判定結(jié)果
CL  -  -  沙門氏菌屬
v  CL  v  大腸埃希氏菌
-  -  CL  弗勞地氏檸檬酸桿菌群
a
-  -  -  噬菌體不裂解培養(yǎng)物
注：CL 表示融合性裂解；– 表示不裂解；v 表示裂解或不裂解。
a 除表 1 的注中所述外，并含陰溝腸桿菌和少數(shù)大腸埃希氏菌。
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5.3 噬菌體不裂解培養(yǎng)物的補充生化試驗
少數(shù)沙門氏菌培養(yǎng)物不被 O-I 噬菌體裂解，少數(shù)大腸埃希氏菌培養(yǎng)物不被相應噬菌體裂解，不被各
種噬菌體裂解的培養(yǎng)物接種三糖鐵瓊脂，按 GB 4789.4 做 5 項生化試驗，血清學分型鑒定后判定結(jié)果。
5.4 血清學分型鑒定及其他補充試驗
5.4.1 沙門氏菌分型鑒定
按 GB 4789.4 進行。如果判定為沙門氏菌時，應得出完整的血清學分型鑒定的結(jié)果。
5.4.2 致瀉大腸埃希氏菌鑒定
5.4.2.1 按 GB 4789.6 和 GB 4789.36 進行。分離的菌株應該同時被同樣的幾個噬菌體裂解后，用大腸
埃希氏菌分型噬菌體試驗，這些菌株應該具有相同的裂解模式，同時測定 1 RTD 噬菌體的裂解情況。
5.4.2.2 產(chǎn)腸毒素大腸埃希氏菌，應有腸毒素試驗的證實。
5.4.2.3 侵襲性大腸埃希氏菌，典型的生化特性為：賴氨酸脫羧酶試驗陰性、無動力、產(chǎn)氣或不產(chǎn)氣
（O124 血清型亦可以為有動力、不產(chǎn)氣），靛基質(zhì)試驗陽性�？蛇M一步做豚鼠角膜試驗，結(jié)果應該為陽
性，質(zhì)粒電泳應證明具有 120~140 Mdal 大質(zhì)粒，PCR 試驗證明具有 ipaC 或 ipaH 基因。
5.4.2.4 產(chǎn)志賀毒素大腸埃希氏菌 O157:H7，典型的生化特性為：乳糖、蔗糖產(chǎn)酸，葡萄糖產(chǎn)酸并多
數(shù)產(chǎn)氣，硫化氫陰性，靛基質(zhì)陽性，山梨醇遲緩發(fā)酵。PCR 試驗證明具有產(chǎn)志賀毒素基因 stx1，stx2 和
溶血毒素基因 hly。1RTD 的 E-2 噬菌體裂解試驗，能被 1RTD 的 E-2 噬菌體裂解（裂解程度包括從 CL
到少數(shù)幾個噬斑）。對于產(chǎn)志賀毒素和溶血毒素其他血清型的大腸埃希氏菌，按照 5.4.2.3 的程序進行鑒
定。
5.4.2.5 腸道致病性大腸埃希氏菌 具有大腸埃希氏菌的典型生化特性，eae 基因（黏附屏蔽基因）的
PCR 試驗為陽性。產(chǎn)志賀毒素大腸埃希氏菌 eae 試驗也可為陽性。EAF（黏附因子質(zhì)�；�因）�� bfp（菌
毛捆綁形成基因）的 PCR 試驗可進一步證實。
5.4.3 志賀氏菌分型鑒定
5.4.3.1 挑取三糖鐵瓊脂上的培養(yǎng)物，按噬菌體裂解模式，選用相應的志賀氏菌分型因子血清，做玻片
凝集試驗。血清學分型鑒定結(jié)果見表 3。
表 3 噬菌體試驗的結(jié)果和志賀氏菌血清學分型鑒定的結(jié)果
序
號
噬菌體裂解模式
志賀氏菌血清學分型鑒定的結(jié)果
O-I  C  Sh  E  CE  E-4  Ent
1  -  -  CL  CL  CL  CL  -  福氏 1-5,(鮑氏 11)
2  -  -  CL  CL  CL  -  -  福氏 1,4,痢疾 2,鮑氏 5,7,11,16,17,(宋內(nèi)氏 I)
3  -  -  CL  CL  -  -  -  宋內(nèi)氏 I,痢疾 2,福氏 4,鮑氏 5,16
4  -  -  CL  CL  -  CL  -  宋內(nèi)氏 II,福氏 3
5  -  -  CL  -  -  -  -  福氏 6,鮑氏 1~4,偶數(shù)型 6~18(除 16 外),痢疾 3~12
6  -  -  CL  -  CL  -  -  鮑氏 9,15
7  -  -  CL  -  -  CL  -  痢疾 1,(宋內(nèi)氏 II)
8  CL  -  CL  -  -  -  -  鮑氏 13 a
注：CL 表示融合性裂解；– 表示不裂解。
a 鮑氏 13 型 DNA 同源性測定不符合志賀氏菌。
5.4.3.2 如按噬菌體裂解模式結(jié)果為福氏志賀氏菌 1~5 型，先用福氏多價血清做凝集試驗。如呈現(xiàn)凝
集，再分別用各型和群因子血清檢查，以確定所屬血清型和亞型（見 GB 4789.5）。
5.4.3.3 如按噬菌體裂解模式結(jié)果為福氏 6 型，鮑氏各型或痢疾 3~12 型，先用福氏 6 型血清做凝集試
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驗。福氏 6 型血清不凝集者，用鮑氏多價血清或痢疾 3~12 型多價血清做凝集試驗，如果呈現(xiàn)凝集，再
分別用各型因子血清檢查。
5.4.3.4 如按噬菌體裂解模式結(jié)果為宋內(nèi)氏 II 相菌而不被宋內(nèi)氏血清凝集時，可直接按噬菌體裂解模
式和粗糙型菌落特征判定之。
5.4.3.5 按噬菌體裂解模式結(jié)果做血清學試驗不凝集者，或雖發(fā)現(xiàn)其被某一個分型因子血清凝集而與噬
菌體裂解模式不相符者，或雖與噬菌體裂解模式相符但不被 1 RTD 的 Sh 噬菌體裂解者，均應做葡萄糖
銨試驗以與大腸埃希氏菌相鑒別。葡萄糖銨試驗陽性者為大腸埃希氏菌。必要時可做如下生化試驗：醋
酸鹽、克氏檸檬酸鹽和粘液酸的利用試驗，賴氨酸和鳥氨酸脫羧酶試驗，七葉苷分解試驗。除宋內(nèi)氏菌
鮑氏 13 型為鳥氨酸脫羧酶陽性，并有少數(shù)宋內(nèi)氏菌菌株可利用黏液酸外，志賀氏菌屬的培養(yǎng)物均為陰性
結(jié)果。上述試驗任何陽性結(jié)果均提示為大腸埃希氏菌（按 GB 4789.5）。
5.4.3.6 檢出的志賀氏菌培養(yǎng)物應符合該群的生化特性。福氏志賀氏菌 6 型符合鮑氏志賀氏菌的特性。
靛基質(zhì)陽性的志賀氏菌血清型有痢疾 2 型、7 型和 8 型，鮑氏 5、7、9、11、13、15、16 和 17 型。福氏
志賀氏菌 1~5 型的靛基質(zhì)反應較弱。靛基質(zhì)陰性的志賀氏菌血清型為痢疾 1 型、3~6 型、9~12 型、福氏
6 型、鮑氏 1~4、6、8、10、12、14 和 18 型、宋內(nèi)氏菌。
5.4.3.7 鮑氏志賀氏菌13型是唯一可被沙門氏菌O-I裂解的菌株，該菌株只被高效價的Sh噬菌體裂解。
5.5 結(jié)果報告
5.5.1 沙門氏菌檢驗的結(jié)果報告
5.5.1.1 O-I 噬菌體裂解，其他噬菌體均不裂解者，經(jīng)沙門氏菌血清分型后報告。
5.5.1.2 各種噬菌體不裂解，生化試驗結(jié)果為沙門氏菌，經(jīng)沙門氏菌血清分型后報告，不可報告為未定
型。
5.5.2 志賀氏菌檢驗的結(jié)果報告
5.5.2.1 Sh 噬菌體裂解，呈現(xiàn)各種裂解模式，血清學試驗與裂解模式相符者，可報告志賀氏菌血清型。
罕見血清型要求被 1 RTD Sh 噬菌體裂解，并符合志賀氏菌生化分群結(jié)果。
5.5.2.2 非如 5.5.2.1 的試驗結(jié)果均報告非志賀氏菌。
5.5.3 致瀉大腸埃希氏菌檢驗的結(jié)果報告
5.5.3.1 E 和或 Sh、E-4 噬菌體裂解，不同來源菌株的裂解模式具有同一性，或各種噬菌體均不裂解，
經(jīng)血清學分型確定者可分別報告為產(chǎn)腸毒素大腸埃希氏菌（腸毒素試驗結(jié)果陽性），侵襲性大腸埃希氏菌
（賴氨酸陰性、動力陰性，O124 可為動力陽性），產(chǎn)志賀毒素大腸埃希氏菌（O157: :H7 和 O157: :NM，
stx1, stx2, hly 試驗陽性）或腸道致病性大腸埃希氏菌（eae 試驗陽性）。
5.5.3.2 非如 5.5.3.1 的結(jié)果均報告為非大腸埃希氏菌或非致瀉大腸埃希氏菌。
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附錄 A
培養(yǎng)基及試劑
A.1 亞硒酸鹽胱氨酸（SC）增菌液
A.1.1 成分
蛋白胨  5.0 g
乳糖  4.0 g
亞硒酸氫鈉  4.0 g
1% L-胱氨酸溶液  1.0 mL
磷酸氫二鈉（無水）  4.5 g
磷酸二氫鈉（無水）  5.5 g
蒸餾水  加至1 000.0mL
A.1.2 制法
稱取 L-胱氨酸 0.1 g（或 DL-胱氨酸 0.2 g），加入 1 mol/L 氫氧化鈉溶液 1.5 mL，使胱氨酸溶解，再
加入蒸餾水 8.5 mL，即為 1% L-胱氨酸溶液。
將蛋白胨、乳糖、胱氨酸加入于蒸餾水 800 mL 中，為基礎液。
將亞硒酸氫鈉加入于 100 mL 蒸餾水中，為 A 液。
將磷酸氫二鈉和磷酸二氫鈉加入于 100 mL 蒸餾水中，為 B 液。
取基礎液 4.0 mL，A 液 0.5 mL，B 液 0.5 mL 混合，測定 pH。校正 pH 至 7.0~7.1，將此 3 份溶液分
別包裝，在 121℃高壓滅菌 15 min（從高壓滅菌器開始加熱到取出不超過 1 h），待其冷卻至常溫后放入
5 ℃冰箱內(nèi)保存。臨用前將 3 份溶液按比例混合，分裝試管。3 份溶液混合后，其 pH 值小于 7.0，則應
調(diào)整磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉的用量和亞硒酸氫鈉的用量。使用前應測定其增菌靈敏度，方法見附錄 B。
不同亞硒酸鹽和磷酸鹽的用量見表 A.1。
表 A.1 不同亞硒酸鹽和磷酸鹽的用量
亞硒酸鹽的種類和用量
g
磷酸鹽的種類和用量
g
主要種類  用量  NaH 2 PO 4 (無水)  Na 2 HPO 4 (無水)
亞硒酸鈉•H 2 O(100%)  5.0  8.6  0.8
亞硒酸鈉•H 2 O (75%)  4.75  7.8  1.25
亞硒酸鈉•H 2 O (50%)  4.5  7.0  2.65
亞硒酸氫鈉(75%)  4.25  6.25  3.58
亞硒酸氫鈉(100%)  4.0  5.5  4.5
亞硒酸氫鈉(75%)  3.85  4.7  5.4
亞硒酸氫鈉(50%)  3.7  3.9  6.35
亞硒酸(75%)  3.55  3.1  7.28
亞硒酸(100%)  3.4  2.3  8.2
注：表中所列均為在 1000mL 增菌液中的用量。
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A.2 四硫磺酸鈉煌綠（TTB）增菌液
A.2.1 成分
A.2.1.1 基礎液
多價胨或初蛋白胨  3.0 g
膽鹽  1.0 g
碳酸鈣  10.0 g
硫代硫酸鈉  30.0 g
0.1%煌綠水溶液  10.0 mL
蒸餾水  加至1 000.0 mL
A.2.1.2 碘液
碘  6.0 g
碘化鉀  5.0 g
蒸餾水  20.0 mL
A.2.2 制法
A.2.2.1 基礎液的配制：將基礎液的成分依次加到 800mL 蒸餾水中，成分溶解后加蒸餾水至 1000mL，
校正 pH 至 7.00.1，經(jīng)高壓滅菌 121℃，15 min。冷卻后保存?zhèn)溆谩?br /> A.2.2.2 碘液的配制：先將碘化鉀溶解于蒸餾水中，再加入碘片，振搖至碘片完全溶解。貯于棕色瓶內(nèi)，
密塞備用。臨用前將基礎液與碘液混合，分裝試管。使用前應測定其增菌靈敏度，方法見附錄 B。
注：為了防止變形桿菌的過度生長，可以在 1000 mL 中加入磺胺噻脞 1.25 mg。
A.3 志賀氏菌（BCT）增菌液
A.3.1 成分
蛋白胨  20.0 g
復合氨基酸  2.0 g
牛肉膏  5.0 g
三號膽鹽  4.5 g
檸檬酸鈉  4.5 g
硫代硫酸鈉  4.5 g
蒸餾水  加至1 000.0 mL
A.3.2 制法
將 A.3.1 成分混合加熱溶解，冷卻至 25℃校正 pH 至 7.20.1，高壓滅菌 121℃，15 min，冷卻后分
裝試管備用。
A.4 營養(yǎng)肉湯（NB）
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A.4.1 成分
蛋白胨  15.0 g
牛肉膏  3.0 g
氯化鈉  5.0 g
蒸餾水  加至1 000.0 mL
A.4.2 制法
將 A.4.1 成分混合加熱溶解，冷卻至 25℃校正 pH 至 7.20.2，高壓滅菌 121 ℃，15 min，備用。
A.5 營養(yǎng)瓊脂（NA）
成分和制法：在 1000 mL 營養(yǎng)肉湯（NB）內(nèi)加入瓊脂 15 g（如用作噬菌體試驗，只加瓊脂 10 g），
高壓滅菌 120 ℃，15 min，備用。
A.6 營養(yǎng)半固體瓊脂（NSA）
成分和制法：在 1000 mL 營養(yǎng)肉湯（NB）內(nèi)加入瓊脂 3 g，高壓滅菌 120 ℃，15 min，備用。
A.7 三糖鐵瓊脂（TSI）
A.7.1 成分
蛋白胨  20.0 g
牛肉膏  3.0 g
乳 糖  10.0 g
蔗 糖  10.0 g
葡萄糖  1.0 g
硫酸亞鐵銨（含6個結(jié)晶水）  0.5 g
酚紅  0.025 g或5 g／L溶液5 mL
氯化鈉  5.0 g
硫代硫酸鈉  0.5 g
瓊 脂  12.0 g
蒸餾水  加至1 000.0 mL
A.7.2 制法
除酚紅和瓊脂外，將其他成分加入 400 mL 蒸餾水中，攪拌均勻，靜置約 10 min，加熱煮沸至完全
溶解，校正 pH 至 7.4±0.1。另將瓊脂加入 600 mL 蒸餾水中，攪拌均勻，靜置約 10 min，加熱煮沸至完
全溶解。將上述兩溶液混合均勻后，再加入酚紅指示劑，混勻，分裝試管（12 mm×100 mm），每管約 2
mL～4 mL，高壓滅菌 120℃ 10 min 或 115℃ 15 min，滅菌后置成高層斜面，呈桔紅色。
A.8 葡萄糖銨瓊脂
A.8.1 成分
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氯化鈉  5.0 g
MgSO 4 ·7H 2 O  0.2 g
NH 4 H 2 PO 4 1.0 g
磷酸氫二鉀（無水）  1.0 g
葡萄糖  5.0 g
瓊脂  20.0 g
0.2%溴麝香草酚藍  40.0 mL
蒸餾水  加至 1 000.0 mL
A.8.2 制法
將 A.8.1 成分混合加熱溶解，冷卻至 25℃校正 pH 至 6.80.1，高壓滅菌 121℃，15 min，放置成斜
面，冷卻后備用。
A.8.3 試驗方法
用接種針輕輕觸及培養(yǎng)物的表面，在鹽水管內(nèi)做成極稀的懸液，肉眼觀察不到混濁，以每一接種環(huán)
內(nèi)含菌數(shù)在20 CFU~100 CFU之間為宜。將接種環(huán)滅菌后挑取菌液接種，同時再以同法接種普通斜面一支
作為對照。于36 ℃1 ℃培養(yǎng)24 h。陽性者葡萄糖銨斜面上有正常大小的菌落生長；陰性者不生長，但
在對照培養(yǎng)基上生長良好。如在葡萄糖銨斜面生長極微小的菌落可視為陰性結(jié)果。
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附錄 B
增菌液靈敏度測定方法
B.1 沙門氏菌增菌液靈敏度測定方法
B.1.1 試驗菌株為沙門氏菌鼠傷寒血清型，沙門氏菌腸炎血清型。
B.1.2 干擾菌株為大腸埃希氏菌。
B.1.3 將試驗菌株和干擾菌株接種營養(yǎng)肉湯管，在 36 ℃1 ℃培養(yǎng) 18 h~24 h。菌液濃度約為
10 9 CFU/mL。大腸埃希氏菌菌液濃度不需測定，應測定沙門氏菌鼠傷寒血清型和腸炎血清型的菌液濃度。
B.1.4 每組 8 支 15 mm150 mm 試管，編號，單號試管內(nèi)每管加入滅菌生理鹽水 4.5 mL，雙號試管內(nèi)
每管加入滅菌生理鹽水 5.0 mL。
B.1.5 在 1 號管內(nèi)加入沙門氏菌營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)液 0.5 mL，在 2 號管內(nèi)加入沙門氏菌培養(yǎng)液 0.05 mL。再
從 2 號管內(nèi)吸取沙門氏菌稀釋菌液，加入到 3 號管內(nèi) 0.5 mL，加入到 4 號管內(nèi) 0.05 mL。按此法繼續(xù)稀
釋到 8 號管。每次稀釋應更換一支吸管。
B.1.6 吸取 6 號管內(nèi)的稀釋菌液各 0.1 mL，分別點加在 2 個營養(yǎng)瓊脂平板上，用彎曲的接種環(huán)將菌液
均勻涂布，待平板表面的菌液干燥后，于 36 ℃1 ℃培養(yǎng) 14 h~24 h。計算平板上生長的沙門氏菌菌落
數(shù)，取其平均數(shù)，約為 100 CFU。
B.1.7 接 B.1.5，排好若干組每組 10 支需要測定的增菌液，第 8 管到第 10 管都加入 8 號稀釋管的稀釋
菌液各 0.1 mL；第 7 管到第 1 管逆序加入該稀釋度的稀釋菌液各 0.1 mL。
B.1.8 逆序向每管內(nèi)加入未稀釋的大腸埃希氏菌菌液 0.1 mL。振搖各管，使加入的菌液混合均勻。在
36 ℃1 ℃培養(yǎng) 18 h~24 h。
B.1.9 振搖各管，使培養(yǎng)物混合均勻。挑取培養(yǎng)物，劃線接種到鑒別培養(yǎng)基上，使能夠出現(xiàn)單個菌落。
在 36 ℃1 ℃培養(yǎng) 18 h~24 h。
B.1.10 觀察在鑒別培養(yǎng)基上沙門氏菌和大腸埃希氏菌菌落的生長情況。按照表 B.1 記錄增菌培養(yǎng)的結(jié)
果。
表 B.1 增菌培養(yǎng)的結(jié)果
增菌培養(yǎng)的結(jié)果  記錄
沙門氏菌菌落數(shù)在 90%以上，大腸埃希氏菌的菌落少見  ++++
沙門氏菌菌落數(shù)約占 80%  +++
沙門氏菌和大腸埃希氏菌的菌落數(shù)分別占 50%  ++
平板上大腸埃希氏菌的菌落為主，可見少數(shù)幾個沙門氏菌的菌落  +
平板上生長的是大腸埃希氏菌的菌落，未見沙門氏菌的菌落  -
注：判定增菌液的靈敏度，是以++++和+++的結(jié)果為準。8~10 號管 3 管中有 1 管或 1 管以上達到++++，或+++的增菌效果，
就可以判定已經(jīng)達到這一管的靈敏度（約 1 CFU ）。++和+的結(jié)果可檢出，也可能被疏忽。
B.2 沙門氏菌增菌液靈敏度簡易測定方法
B.2.1 用于核對已經(jīng)過測定的增菌液的靈敏度。
B.2.2 試驗菌株、干擾菌株，及將菌株接種到營養(yǎng)肉湯和培養(yǎng)的方法均同 B.1.1~B.1.3.。
B.2.3 準備 15 mm150 mm 滅菌試管 2 支，分別加入滅菌生理鹽水 5 mL。用直徑為 3 mm 的接種環(huán)挑
取試驗菌株的營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)物 1 滿環(huán)（5 L），稀釋到 5 mL 生理鹽水中，此時相當于 1∶10 3 稀釋。再
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挑取此稀釋液 1 滿環(huán)，稀釋到另一支 5 mL 生理鹽水管中，此時相當于 1:10 6 稀釋。吸取此稀釋液 0.1 mL，
涂布接種于一個營養(yǎng)瓊脂平板上，用于菌落計數(shù)，菌落數(shù)約為 80 CFU ~100 CFU。再將此稀釋液做成 1:10
和 1:100 稀釋。
B.2.4 在 2~4 支增菌液管內(nèi)，各加入未稀釋的大腸埃希氏菌肉湯培養(yǎng)物 0.1 mL，再在其中一管內(nèi)加入
1:10 稀釋的試驗菌液（B.2.3）0.1 mL，另外的 1~3 支增菌液管內(nèi)各加入 1:100 稀釋的試驗菌液（B.2.3）
0.1 mL，將試管內(nèi)液體振搖使其均勻。在 36 ℃1 ℃培養(yǎng) 14 h~24 h。劃線接種鑒別培養(yǎng)基，在 36 ℃1 ℃
培養(yǎng) 14 h~24 h 后觀察結(jié)果。接種 1:10 稀釋的試驗菌液（B.2.3）的管相當于 B.1 試驗方法中的第 7 管，
后面各管相當于第 8 管～第 10 管。
B.3 志賀氏菌增菌液靈敏度測定方法
B.3.1 試驗菌株 福氏志賀氏菌 2a 型，鮑氏志賀氏菌 4 型，痢疾志賀氏菌 2 型，宋內(nèi)氏志賀氏菌各 1
株。
B.3.2 干擾菌株 大腸埃希氏菌 10 株。
B.3.3 對比增菌液，以 GN 肉湯作為對比增菌液，以判定所測定的增菌液是否優(yōu)于 GN 肉湯。