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中華人民共和國國家標準
GB 4789.9—2014
食品安全國家標準
食品微生物學檢驗 空腸彎曲菌檢驗
2014-12-01 發(fā)布  2015-05-01 實施
GB 4789.9—2014
I
前 言
本標準代替 GB/T 4789.9-2008 《食品衛(wèi)生微生物學檢驗 空腸彎曲菌檢驗》。
本標準與GB/T 4789.9-2008 相比，主要變化如下：
——修改了標準的中文名稱；
——修改了范圍；
——修改了設(shè)備和材料；
——修改了培養(yǎng)基和試劑；
——修改了樣品處理；
——刪除了藥物敏感性試驗；
——刪除了第二法 全自動酶聯(lián)熒光免疫分析儀篩選法。
GB 4789.9—2014
1
食品安全國家標準
食品微生物學檢驗 空腸彎曲菌檢驗
1 范圍
本標準規(guī)定了食品中空腸彎曲菌（Campylobacter jejuni）的檢驗方法。
本標準適用于食品中空腸彎曲菌的檢驗。
2 設(shè)備和材料
除微生物實驗室常規(guī)滅菌及培養(yǎng)設(shè)備外，其他設(shè)備和材料如下：
a)  恒溫培養(yǎng)箱：25 ℃±1 ℃、36 ℃±1 ℃、42 ℃±1 ℃；
b)  冰箱：2 ℃～5 ℃；
c)  恒溫振蕩培養(yǎng)箱：36 ℃±1 ℃、42 ℃±1 ℃；
d)  天平：感量 0.1 g；
e)  均質(zhì)器與配套均質(zhì)袋；
f)  振蕩器；
g)  無菌吸管：1 mL（具 0.01 mL 刻度）、10 mL（具 0.1 mL 刻度）或微量移液器及吸頭；
h)  無菌錐形瓶：容量 100 mL、200 mL、2 000 mL；
i)  無菌培養(yǎng)皿：直徑 90 mm；
j)  pH 計或 pH 比色管或精密 pH 試紙；
k)  水浴裝置：36 ℃±1 ℃、100 ℃；
l)  微需氧培養(yǎng)裝置：提供微需氧條件（5% 氧氣、10% 二氧化碳和 85% 氮氣）；
m) 過濾裝置及濾膜（0.22 μm、0.45 μm）；
n)  顯微鏡：10 倍～100 倍，有相差功能；
o)  離心機：離心速度≥20000 g；
p)  比濁儀；
q)  微生物生化鑒定系統(tǒng)。
3 培養(yǎng)基和試劑
3.1 Bolton 肉湯（Bolton broth）：見附錄 A 中 A.1。
3.2 改良 CCD 瓊脂（modified Charcoal Cefoperazone Deoxycholate Agar, mCCDA）：見附錄 A 中 A.2。
3.3 哥倫比亞血瓊脂（Columbia blood agar）：見附錄 A 中 A.3。
3.4 布氏肉湯（Brucella broth）：見附錄 A 中 A.4。
3.5 氧化酶試劑：見附錄 A 中 A.5。
3.6 馬尿酸鈉水解試劑：見附錄 A 中 A.6。
3.7 Skirrow 血瓊脂（Skirrow blood agar）：見附錄 A 中 A.7。
3.8 吲哚乙酸酯紙片：見附錄 A 中 A.8。
3.9 0.1%蛋白胨水：見附錄 A 中 A.9。
3.10 1mol / L 硫代硫酸鈉（Na 2 S 2 O 3 ）溶液：見附錄 A 中 A.10。
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3.11 3%過氧化氫（H 2 O 2 ）溶液：見附錄 A 中 A.11。
3.12 空腸彎曲菌顯色培養(yǎng)基。
3.13 生化鑒定試劑盒或生化鑒定卡。
4 檢驗程序
空腸彎曲菌檢驗程序見圖 1。
圖 1 空腸彎曲菌檢驗程序
24 h～48 h
樣品處理
Bolton 肉湯預(yù)增菌，微需氧
接種 Skirrow 與 mCCD 瓊脂平板，或顯色培養(yǎng)基
Bolton 肉湯增菌，微需氧
鏡 檢  動力
試驗
微需氧 25 ℃±1 ℃
生長試驗
有氧 42 ℃±1 ℃
生長試驗
氧化酶
試驗
彎曲菌屬
過氧化氫酶
試驗
吲哚乙酸酯水
解試驗
馬尿酸鈉
水解試驗
空腸彎曲菌
報 告
挑取可疑菌落，接種哥倫比亞血瓊脂平板
36 ℃±1 ℃  4 h
42 ℃±1 ℃
42 ℃±1 ℃
24 h～48 h
42 ℃±1 ℃
24 h～48 h
GB 4789.9—2014
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5 操作步驟
5.1 樣品處理
5.1.1 一般樣品
取 25 g（mL) 樣品（水果、蔬菜、水產(chǎn)品為 50 g）加入盛有 225 mL Bolton 肉湯的有濾網(wǎng)的均質(zhì)袋
中（若為無濾網(wǎng)均質(zhì)袋可使用無菌紗布過濾），用拍擊式均質(zhì)器均質(zhì) 1 min～2 min，經(jīng)濾網(wǎng)或無菌紗布過
濾，將濾過液進行培養(yǎng)。
5.1.2 整禽等樣品
用 200 mL 0.1%的蛋白胨水中充分沖洗樣品的內(nèi)外部，并振蕩 2 min～3 min，經(jīng)無菌紗布過濾至 250
mL 離心管中，16000 g 離心 15 min 后棄去上清，用 10 mL 0.1%蛋白胨水懸浮沉淀，吸取 3 mL 于 100 mL
Bolton 肉湯中進行培養(yǎng)。
5.1.3 貝類
取至少 12 個帶殼樣品，除去外殼后將所有內(nèi)容物放到均質(zhì)袋中，用拍擊式均質(zhì)器均質(zhì) 1 min～2 min，
取25g樣品至225 mL Bolton肉湯中（1:10稀釋），充分震蕩后再轉(zhuǎn)移25 mL于225 mL Bolton肉湯中（1:100
稀釋），將 1:10 和 1:100 稀釋的 Bolton 肉湯同時進行培養(yǎng)。
5.1.4 蛋黃液或蛋漿
取 25 g （mL)樣品于 125 mL Bolton 肉湯中并混勻（1:6 稀釋），再轉(zhuǎn)移 25 mL 于 100 mL Bolton 肉
湯中并混勻（1:30 稀釋），同時將 1:6 和 1:30 稀釋的 Bolton 肉湯進行培養(yǎng)。
5.1.5 鮮乳、冰淇淋、奶酪等
若為液體乳制品取 50 g；若為固體乳制品取 50 g 加入盛有 50 mL 0.1%蛋白胨水的有濾網(wǎng)均質(zhì)袋中，
用拍擊式均質(zhì)器均質(zhì) 15 s～30 s，保留過濾液。必要時調(diào)整 pH 值至 7.5±0.2，將液體乳制品或濾過液以
20000 g 離心 30 min 后棄去上清，用 10 mL Bolton 肉湯懸浮沉淀（盡量避免帶入油層），再轉(zhuǎn)移至 90 mL
Bolton 肉湯進行培養(yǎng)。
5.1.6 需表面涂拭檢測的樣品
無菌棉簽擦拭檢測樣品的表面（面積至少 100 cm 2 以上），將棉簽頭剪落到 100 mL Bolton 肉湯中進
行培養(yǎng)。
5.1.7 水樣
將 4 L 的水（對于氯處理的水，在過濾前每升水中加入 5 mL 1mol/L 硫代硫酸鈉溶液）經(jīng) 0.45 μm
濾膜過濾，把濾膜浸沒在 100 mL Bolton 肉湯中進行培養(yǎng)。
5.2 預(yù)增菌與增菌
在微需氧條件下，36 ℃±1 ℃培養(yǎng) 4 h，如條件允許配以 100 r/min 的速度進行振蕩。必要時測定增菌
液的 pH 值并調(diào)整至 7.4 ± 0.2，42 ℃±1 ℃繼續(xù)培養(yǎng) 24 h～48 h。
5.3 分離
將 24 h 增菌液、48 h 增菌液及對應(yīng)的 1:50 稀釋液分別劃線接種于 Skirrow 血瓊脂與 mCCDA 瓊脂平
板上，微需氧條件下 42 ℃±1 ℃培養(yǎng) 24 h～48 h。另外可選擇使用空腸彎曲菌顯色平板作為補充。
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觀察24 h培養(yǎng)與48 h培養(yǎng)的瓊脂平板上的菌落形態(tài)，mCCDA瓊脂平板上的可疑菌落通常為淡灰色，
有金屬光澤、潮濕、扁平，呈擴散生長的傾向。Skirrow 血瓊脂平板上的第一型可疑菌落為灰色、扁平、
濕潤有光澤，呈沿接種線向外擴散的傾向；第二型可疑菌落常呈分散凸起的單個菌落，邊緣整齊、發(fā)亮。
空腸彎曲菌顯色培養(yǎng)基上的可疑菌落按照說明進行判定。
5.4 鑒定
5.4.1 彎曲菌屬的鑒定
5.4.1.1 概述
挑取 5 個（如少于 5 個則全部挑取）或更多的可疑菌落接種到哥倫比亞血瓊脂平板上，微需氧條件
下 42 ℃±1 ℃培養(yǎng) 24 h～48 h，按照 5.4.1.1～5.4.1.5 進行鑒定，結(jié)果符合表 1 的可疑菌落確定為彎曲菌
屬。
表 1 彎曲菌屬的鑒定
項 目  彎曲菌屬特性
形態(tài)觀察
革蘭氏陰性，菌體彎曲如小逗點狀，兩菌體的末端相接時呈 S
形、螺旋狀或海鷗展翅狀
a
動力觀察  呈現(xiàn)螺旋狀運動
b
氧化酶試驗  陽 性
微需氧條件下 25 ℃±1 ℃生長試驗  不生長
有氧條件下 42 ℃±1 ℃生長試驗  不生長
a 有些菌株的形態(tài)不典型。
b 有些菌株的運動不明顯。
5.4.1.2 形態(tài)觀察
挑取可疑菌落進行革蘭氏染色，鏡檢。
5.4.1.3 動力觀察
挑取可疑菌落用 1 mL 布氏肉湯懸浮，用相差顯微鏡觀察運動狀態(tài)。
5.4.1.4 氧化酶試驗
用鉑/銥接種環(huán)或玻璃棒挑取可疑菌落至氧化酶試劑潤濕的濾紙上，如果在 10 s 內(nèi)出現(xiàn)紫紅色、紫羅
蘭或深藍色為陽性。
5.4.1.5 微需氧條件下 25 ℃±1 ℃生長試驗
挑取可疑菌落，接種到哥倫比亞血瓊脂平板上，微需氧條件下 25 ℃±1 ℃培養(yǎng) 44 h±4 h，觀察細菌
生長情況。
5.4.1.6 有氧條件下 42 ℃±1 ℃生長試驗
挑取可疑菌落，接種到哥倫比亞血瓊脂平板上，有氧條件下 42 ℃±1 ℃培養(yǎng) 44 h±4 h，觀察細菌生
長情況。
5.4.2 空腸彎曲菌的鑒定
5.4.2.1 過氧化氫酶試驗
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挑取菌落，加到干凈玻片上的 3%過氧化氫溶液中，如果在 30 s 內(nèi)出現(xiàn)氣泡則判定結(jié)果為陽性。
5.4.2.2 馬尿酸鈉水解試驗
挑取菌落，加到盛有 0.4 mL 1%馬尿酸鈉的試管中制成菌懸液�；旌暇鶆蚝笤� 36 ℃±1 ℃水浴中溫育
2 h 或 36 ℃±1 ℃培養(yǎng)箱中溫育 4 h。沿著試管壁緩緩加入 0.2 mL 茚三酮溶液，不要振蕩，在 36 ℃±1 ℃
的水浴或培養(yǎng)箱中再溫育 10 min 后判讀結(jié)果。若出現(xiàn)深紫色則為陽性；若出現(xiàn)淡紫色或沒有顏色變化則
為陰性。
5.4.2.3 吲哚乙酸酯水解試驗
挑取菌落至吲哚乙酸酯紙片上，再滴加一滴滅菌水。如果吲哚乙酸酯水解，則在 5 min～10 min 內(nèi)
出現(xiàn)深藍色；若無顏色變化則表示沒有發(fā)生水解�？漳c彎曲菌的鑒定結(jié)果見表 2。
表 2 空腸彎曲菌的鑒定
特征
空腸彎曲菌
（C. jejuni）
結(jié)腸彎曲菌
（C. coli）
海鷗彎曲菌
（C. lari）
烏普薩拉彎曲菌
(C. upsaliensis)
過氧化氫酶試驗  ＋  ＋  ＋  －或微弱
馬尿酸鹽水解試驗  ＋  －  －  －
吲哚乙酸脂水解試驗  ＋  ＋  －  ＋
注：＋表示陽性；－表示陰性。
5.4.2.4 替代試驗
對于確定為彎曲菌屬的菌落，可使用生化鑒定試劑盒或生化鑒定卡代替 5.4.2.1~5.4.2.3 進行鑒定。
5.5 結(jié)果報告
綜合以上試驗結(jié)果，報告檢樣單位中檢出或未檢出空腸彎曲菌。
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附錄 A
培養(yǎng)基與試劑
A.1 Bolton 肉湯 （Bolton broth）
A.1.1 基礎(chǔ)培養(yǎng)基
A.1.1.1 成分
動物組織酶解物  10.0 g
乳白蛋白水解物  5.0 g
酵母浸膏  5.0 g
氯化鈉  5.0 g
丙酮酸鈉  0.5 g
偏亞硫酸氫鈉  0.5 g
碳酸鈉  0.6 g
α-酮戊二酸  1.0 g
蒸餾水  1 000.0 mL
A.1.1.2 制法
將 A.1.1.1 中各成分溶于蒸餾水中，121 ℃ 滅菌 15 min，備用。
A.1.2 無菌裂解脫纖維綿羊或馬血
對無菌脫纖維綿羊或馬血通過反復凍融進行裂解或使用皂角苷進行裂解。
A.1.3 抗生素溶液
A.1.3.1 成分
頭孢哌酮 (cefoperazone)  0.02 g
萬古霉素（vancomycin）  0.02 g
三甲氧芐胺嘧啶乳酸鹽（trimethoprim lactate） 0.02 g
兩性霉素 B（amphotercin B）  0.01 g
多粘菌素 B（polymyxin B）  0.01 g
乙醇 / 滅菌水 （50 /50，體積分數(shù)）  5.0 mL
A.1.3.2 制法
將 A.1.3.1 中各成分溶解于乙醇/滅菌水混合溶液中。
A.1.4 完全培養(yǎng)基
A.1.4.1 成分
基礎(chǔ)培養(yǎng)基 1 000.0 mL
無菌裂解脫纖維綿羊或馬血  50.0 mL
抗生素溶液  5.0 mL
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A.1.4.2 制法
當基礎(chǔ)培養(yǎng)基的溫度約為 45 ℃左右時，無菌加入綿羊或馬血和抗生素溶液，混勻，校正 pH 至 7.4
±0.2（25 ℃），常溫下放置不得超過 4 h，或在 4 ℃左右避光保存不得超過 7 d。
A.2 改良 CCD 瓊脂 (modified Charcoal Cefoperazone Deoxycholate Agar, mCCDA)
A.2.1 基礎(chǔ)培養(yǎng)基
A.2.1.1 成分
肉浸液  10.0 g
動物組織酶解物  10.0 g
氯化鈉  5.0 g
木炭  4.0 g
酪蛋白酶解物  3.0 g
去氧膽酸鈉  1.0 g
硫酸亞鐵  0.25 g
丙酮酸鈉  0.25 g
瓊脂  8.0 g～18.0 g
蒸餾水  1 000.0 mL
A.2.1.2 制法
將 A.2.1.1 中各成分溶于蒸餾水中，121 ℃ 滅菌 15 min，備用。
A.2.2 抗生素溶液
A.2.2.1 成分
頭孢哌酮（cefoperazone）  0.032 g
兩性霉素 B（amphotericin B）  0.01 g
利福平（rifampicin）  0.01 g
乙醇 / 滅菌水（50 /50，體積分數(shù)）  5.0 mL
A.2.2.2 制法
將 A.2.2.1 中各成分溶解于乙醇/滅菌水混合溶液中。
A.2.3 完全培養(yǎng)基
A.2.3.1 成分
基礎(chǔ)培養(yǎng)基 1 000.0 mL
抗生素溶液  5.0 mL
A.2.3.2 制法
當基礎(chǔ)培養(yǎng)基的溫度約為 45 ℃左右時，加入抗生素溶液，混勻。校正 pH 至 7.4±0.2（25 ℃）。傾
注 15 mL 于無菌平皿中，靜置至培養(yǎng)基凝固。使用前需預(yù)先干燥平板。制備的平板未干燥時在室溫放置
不得超過 4 h，或在 4 ℃左右冷藏不得超過 7 d。
A.3 哥倫比亞血瓊脂（Columbia blood agar）
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A.3.1 基礎(chǔ)培養(yǎng)基
A.3.1.1 成分
動物組織酶解物  23.0 g
淀粉  1.0 g
氯化鈉  5.0 g
瓊脂  8.0g～18.0 g
蒸餾水  1 000.0 mL
A.3.1.2 制法
將 A.3.1.1 成分溶于蒸餾水中，121 ℃ 滅菌 15 min，備用。
A.3.2 無菌脫纖維綿羊血
無菌操作條件下，將綿羊血倒入盛有滅菌玻璃珠的容器中，振搖約 10 min，靜置后除去附有血纖維
的玻璃珠即可。
A.3.3 完全培養(yǎng)基
A.3.3.1 成分
基礎(chǔ)培養(yǎng)基  1 000.0 mL
無菌脫纖維綿羊血 50.0 mL
A.3.3.2 制法
當基礎(chǔ)培養(yǎng)基的溫度為 45 ℃左右時，無菌加入綿羊血，混勻。校正 pH 至 7.3±0.2（25 ℃）。傾注
15 mL 完全培養(yǎng)基于無菌平皿中，靜置至培養(yǎng)基凝固。制備的平板未干燥時在室溫放置不得超過 4 h，
或在 4 ℃左右冷藏不得超過 7 d。
A.4 布氏肉湯 (Brucella broth)
A.4.1 成分
酪蛋白酶解物  10.0 g
動物組織酶解物  10.0 g
葡萄糖  1.0 g
酵母浸膏  2.0 g
氯化鈉  5.0 g
亞硫酸氫鈉  0.1 g
蒸餾水  1 000.0 mL
A.4.2 制法
將 A.4.1 中各成分溶于蒸餾水中，校正 pH 至 7.0±0.2（25 ℃），121 ℃ 滅菌 15 min，備用。
A.5 氧化酶試劑
A.5.1 成分
四甲基對苯二胺鹽酸鹽  1.0 g
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蒸餾水  100.0 mL
A.5.2 制法
使用前將 A.5.1 中各成分溶于蒸餾水中。
A.6 馬尿酸鈉水解試劑
A.6.1 馬尿酸鈉溶液
A.6.1.1 成分
馬尿酸鈉  10.0 g
磷酸鹽緩沖液（PBS）組分： 
氯化鈉  8.5 g
磷酸氫二鈉  8.98 g
磷酸二氫鈉  2.71 g
蒸餾水  1 000.0 mL
A.6.1.2 制法
將馬尿酸鈉溶于磷酸鹽緩沖溶液中，過濾除菌。無菌分裝，每管 0.4 mL，儲存于-20 ℃。
A.6.2 3.5% (水合)茚三酮溶液 (質(zhì)量/體積)
A.6.2.1 成分
（水合）茚三酮 （ninhydrin）  1.75 g
丙酮  25.0 mL
丁醇 25.0 mL
A.6.2.2 制備
將（水合）茚三酮溶解于丙酮/丁醇混合液中。該溶液在避光冷藏時不超過 7 d。
A.7 Skirrow 血瓊脂 （Skirrow blood agar）
A.7.1 基礎(chǔ)培養(yǎng)基
A.7.1.1 成分
蛋白胨  15.0 g
胰蛋白胨  2.5 g
酵母浸膏  5.0 g
氯化鈉 5.0 g
瓊脂  15.0 g
蒸餾水  1 000.0 mL
A.7.1.2 制法
將 A.7.1.1 中各成分溶于蒸餾水中，121 ℃ 滅菌 15 min，備用。
A.7.2 FBP 溶液
A.7.2.1 成分
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10
丙酮酸鈉  0.25 g
焦亞硫酸鈉  0.25 g
硫酸亞鐵  0.25 g
蒸餾水  100.0 mL
A.7.2.2 制法
將 A.7.2.1 中各成分溶于蒸餾水中，經(jīng) 0.22 μm 濾膜過濾除菌。FBP 根據(jù)需要量現(xiàn)用現(xiàn)配，在-70 ℃
儲存不超過 3 個月或-20 ℃儲存不超過 1 個月。
A.7.3 抗生素溶液
A.7.3.1 成分
頭孢哌酮（cefoperazone）  0.032 g
兩性霉素 B（amphotericin B）  0.01 g
利福平（rifampicin）  0.01 g
乙醇 / 滅菌水（50 /50，體積
分數(shù)）
5.0 mL
A.7.3.2 制法
將 A.7.3.1 中各成分溶解于乙醇/滅菌水混合溶液中。
A.7.4 無菌脫纖維綿羊血
無菌操作條件下，將綿羊血倒入盛有滅菌玻璃珠的容器中，振搖約 10 min，靜置后除去附有血纖維
的玻璃珠即可。
A.7.5 完全培養(yǎng)基
A.7.5.1 成分
基礎(chǔ)培養(yǎng)基 1 000.0 mL
FBP 溶液 5.0 mL
抗生素溶液 5.0 mL
無菌脫纖維綿羊血 50.0 mL
A.7.5.2 制法
當基礎(chǔ)培養(yǎng)基的溫度約為 45 ℃左右時，加入 FBP 溶液、抗生素溶液與凍融的無菌脫纖維綿羊血，
混勻。校正 pH 至 7.4±0.2（25 ℃）。傾注 15 mL 于無菌平皿中，靜置至培養(yǎng)基凝固。預(yù)先制備的平板
未干燥時在室溫放置不得超過 4 h，或在 4 ℃左右冷藏不得超過 7 d。
A.8 吲哚乙酸酯紙片
A.8.1 成分
吲哚乙酸脂  0.1 g
丙酮  1.0 mL
A.8.2 制法
GB 4789.9—2014
11
將吲哚乙酸脂溶于丙酮中，吸取 25 μL～50 μL 溶液于空白紙片上（直徑為 0.6 cm～1.2 cm）。室溫干
燥，用帶有硅膠塞的棕色試管/瓶于 4 ℃保存。
A.9 0.1%蛋白胨水
A.9.1 成分
蛋白胨  1.0 g
蒸餾水  1 000.0 mL
A.9.2 制法
將蛋白胨溶解于蒸餾水中，校正 pH 至 7.0 ± 0.2（25 ℃），121 ℃高壓滅菌 15 min。
A.10 1 mol/L 硫代硫酸鈉（Na 2 S 2 O 3 ）溶液
A.10.1 成分
硫代硫酸鈉（無水）  160.0 g
碳酸鈉（無水）  2.0 g
蒸餾水  1 000.0 mL
A.10.2 制法
稱取 160 g 無水硫代硫酸鈉，加入 2g 無水碳酸鈉，溶于 1000 mL 水中，緩緩煮沸 10min，冷卻。
A.11 3％過氧化氫(H 2 O 2 )溶液
A.11.1 成分
30％過氧化氫(H 2 O 2 )溶液  100.0 mL
蒸餾水  900.0 mL
A.11.2 制法
吸取100mL30％過氧化氫(H 2 O 2 )溶液，溶于900mL蒸餾水中，混勻，分裝備用。