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中 華 人 民 共 和 國(guó) 國(guó) 家 標(biāo) 準(zhǔn)
GB4789.3—2016
食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)
食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 大腸菌群計(jì)數(shù)
2 0 1 6 - 1 2 - 2 3發(fā)布 2 0 1 7 - 0 6 - 2 3實(shí)施
中華人民共和國(guó)國(guó)家衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì)
國(guó) 家 食 品 藥 品 監(jiān) 督 管 理 總 局 發(fā) 布GB4 7 8 9.3—2 0 1 6
Ⅰ
前 言
本 標(biāo) 準(zhǔn) 代 替 GB4 7 8 9.3—2 0 1 0《 食 品 安 全 國(guó) 家 標(biāo) 準(zhǔn) 食 品 微 生 物 學(xué) 檢 驗(yàn) 大 腸 菌 群 計(jì) 數(shù)》、
GB /T4 7 8 9.3 2—2 0 0 2《 食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn) 大腸菌群的快速檢測(cè)》和 SN/T0 1 6 9—2 0 1 0《 進(jìn)出口
食品中大腸菌群、糞大腸菌群和大腸桿菌檢測(cè)方法》大腸菌群計(jì)數(shù)部分。
本標(biāo)準(zhǔn)與 GB4 7 8 9.3—2 0 1 0相比,主要變化如下:
— — —增加了檢驗(yàn)原理;
— — —修改了適用范圍;
— — —修改了典型菌落的形態(tài)描述;
— — —修改了第二法平板菌落數(shù)的選擇;
— — —修改了第二法證實(shí)試驗(yàn);
— — —修改了第二法平板計(jì)數(shù)的報(bào)告。GB4 7 8 9.3—2 0 1 6
1
食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)
食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 大腸菌群計(jì)數(shù)
1 范圍
本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了食品中大腸菌群(C o l i f o r ms)計(jì)數(shù)的方法。
本標(biāo)準(zhǔn)第一法適用于大腸菌群含量較低的食品中大腸菌群的計(jì)數(shù);第二法適用于大腸菌群含量較
高的食品中大腸菌群的計(jì)數(shù)。
2 術(shù)語(yǔ)和定義
2.1
大腸菌群 C o l i f o r m s
在一定培養(yǎng)條件下能發(fā)酵乳糖、產(chǎn)酸產(chǎn)氣的需氧和兼性厭氧革蘭氏陰性無芽胞桿菌。
2.2
最可能數(shù) Mo s tp r o b a b l en u mb e r;MPN
基于泊松分布的一種間接計(jì)數(shù)方法。
3 檢驗(yàn)原理
3.1 MPN 法
MPN 法是統(tǒng)計(jì)學(xué)和微生物學(xué)結(jié)合的一種定量檢測(cè)法。 待測(cè)樣品經(jīng)系列稀釋并培養(yǎng)后,根據(jù)其未
生長(zhǎng)的最低稀釋度與生長(zhǎng)的最高稀釋度,應(yīng)用統(tǒng)計(jì)學(xué)概率論推算出待測(cè)樣品中大腸菌群的最大可能數(shù)。
3.2 平板計(jì)數(shù)法
大腸菌群在固體培養(yǎng)基中發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸,在指示劑的作用下形成可計(jì)數(shù)的紅色或紫色,帶有或不帶
有沉淀環(huán)的菌落。
4 設(shè)備和材料
除微生物實(shí)驗(yàn)室常規(guī)滅菌及培養(yǎng)設(shè)備外,其他設(shè)備和材料如下:
4.1 恒溫培養(yǎng)箱:3 6 ℃ ±1 ℃。
4.2 冰箱:2 ℃~5 ℃。
4.3 恒溫水浴箱:4 6℃±1℃。
4.4 天平:感量 0.1g。
4.5 均質(zhì)器。
4.6 振蕩器。
4.7 無菌吸管:1mL(具 0.0 1mL 刻度)、1 0mL(具 0.1mL 刻度)或微量移液器及吸頭。
4.8 無菌錐形瓶:容量5 0 0mL。
4.9 無菌培養(yǎng)皿:直徑 9 0mm。GB4 7 8 9.3—2 0 1 6
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4.1 0 pH 計(jì)或 pH 比色管或精密pH 試紙。
4.1 1 菌落計(jì)數(shù)器。
5 培養(yǎng)基和試劑
5.1 月桂基硫酸鹽胰蛋白胨(l a u r y ls u l f a t et r y p t o s e, L ST)肉湯:見 A.1。
5.2 煌綠乳糖膽鹽(b r i l l i a n tg r e e nl a c t o s eb i l e, BGLB)肉湯:見 A.2。
5.3 結(jié)晶紫中性紅膽鹽瓊脂(v i o l e tr e db i l ea g a r, VRBA):見 A.3。
5.4 無菌磷酸鹽緩沖液:見 A.4。
5.5 無菌生理鹽水:見 A.5。
5.6 1mo l / LNa OH 溶液:見 A.6。
5.7 1mo l / LHC l溶液:見 A.7。
第一法 大腸菌群 MPN 計(jì)數(shù)法
6 檢驗(yàn)程序
大腸菌群 MPN 計(jì)數(shù)的檢驗(yàn)程序見圖1。
圖 1 大腸菌群 MPN 計(jì)數(shù)法檢驗(yàn)程序GB4 7 8 9.3—2 0 1 6
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7 操作步驟
7.1 樣品的稀釋
7.1.1 固體和半固體樣品:稱取2 5g樣品,放入盛有2 2 5mL磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無菌均質(zhì)杯
內(nèi) ,80 0 0r /m i n~1 00 0 0r /m i n均質(zhì)1m i n~2m i n,或放入盛有2 2 5mL磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無
菌均質(zhì)袋中,用拍擊式均質(zhì)器拍打1m i n~2m i n,制成1∶1 0的樣品勻液。
7.1.2 液體樣品:以無菌吸管吸取2 5mL樣品置盛有2 2 5mL磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無菌錐形瓶
(瓶?jī)?nèi)預(yù)置適當(dāng)數(shù)量的無菌玻璃珠)或其他無菌容器中充分振搖或置于機(jī)械振蕩器中振搖,充分混勻,制
成1∶1 0的樣品勻液。
7.1.3 樣品勻液的pH 應(yīng)在6.5~7.5之間,必要時(shí)分別用1mo l / LNa OH 或1mo l / LHC l調(diào)節(jié)。
7.1.4 用 1mL 無菌吸管或微量移液器吸取1∶1 0樣品勻液1mL,沿管壁緩緩注入9mL磷酸鹽緩沖
液或生理鹽水的無菌試管中(注意吸管或吸頭尖端不要觸及稀釋液面),振搖試管或換用1支1mL無
菌吸管反復(fù)吹打,使其混合均勻,制成1∶1 0 0的樣品勻液。
7.1.5 根據(jù)對(duì)樣品污染狀況的估計(jì),按上述操作,依次制成十倍遞增系列稀釋樣品勻液。 每遞增稀釋
1次, 換用1支1mL無菌吸管或吸頭。 從制備樣品勻液至樣品接種完畢,全過程不得超過1 5m i n。
7.2 初發(fā)酵試驗(yàn)
每個(gè)樣品,選擇3個(gè)適宜的連續(xù)稀釋度的樣品勻液(液體樣品可以選擇原液),每個(gè)稀釋度接種3管
月桂基硫酸鹽胰蛋白胨(L S T)肉湯,每管接種1mL(如接種量超過1mL,則用雙料 L S T 肉湯),3 6 ℃±
1 ℃ 培養(yǎng)2 4h±2h,觀察倒管內(nèi)是否有氣泡產(chǎn)生,2 4h±2h產(chǎn)氣者進(jìn)行復(fù)發(fā)酵試驗(yàn)(證實(shí)試驗(yàn)),如未
產(chǎn)氣則繼續(xù)培養(yǎng)至4 8h±2h,產(chǎn)氣者進(jìn)行復(fù)發(fā)酵試驗(yàn)。 未產(chǎn)氣者為大腸菌群陰性。
7.3 復(fù)發(fā)酵試驗(yàn)(證實(shí)試驗(yàn))
用接種環(huán)從產(chǎn)氣的 L ST 肉湯管中分別取培養(yǎng)物1 環(huán), 移種于煌綠乳糖膽鹽肉湯( BGLB) 管中,
3 6 ℃±1 ℃培養(yǎng)4 8h±2h,觀察產(chǎn)氣情況。 產(chǎn)氣者,計(jì)為大腸菌群陽(yáng)性管。
7.4 大腸菌群最可能數(shù)(MPN)的報(bào)告
按7.3確證的大腸菌群 BGLB陽(yáng)性管數(shù),檢索 MPN 表(見附錄 B),報(bào)告每g(mL)樣品中大腸菌群
的 MPN 值。
第二法 大腸菌群平板計(jì)數(shù)法
8 檢驗(yàn)程序
大腸菌群平板計(jì)數(shù)法的檢驗(yàn)程序見圖2。GB4 7 8 9.3—2 0 1 6
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圖 2 大腸菌群平板計(jì)數(shù)法檢驗(yàn)程序
9 操作步驟
9.1 樣品的稀釋
按7.1進(jìn)行。
9.2 平板計(jì)數(shù)
9.2.1 選取2個(gè)~3個(gè)適宜的連續(xù)稀釋度, 每個(gè)稀釋度接種2個(gè)無菌平皿,每皿1mL。 同時(shí)取1mL
生理鹽水加入無菌平皿作空白對(duì)照。
9.2.2 及時(shí)將1 5mL~2 0mL融化并恒溫至4 6℃的結(jié)晶紫中性紅膽鹽瓊脂( VRBA)約傾注于每個(gè)平
皿中。 小心旋轉(zhuǎn)平皿,將培養(yǎng)基與樣液充分混勻,待瓊脂凝固后,再加3mL~4mLVRBA 覆蓋平板表
層。 翻轉(zhuǎn)平板,置于3 6 ℃±1 ℃培養(yǎng)1 8h~2 4h。
9.3 平板菌落數(shù)的選擇
選取菌落數(shù)在1 5CFU~1 5 0CFU 之間的平板,分別計(jì)數(shù)平板上出現(xiàn)的典型和可疑大腸菌群菌落
(如菌落直徑較典型菌落小)。 典型菌落為紫紅色,菌落周圍有紅色的膽鹽沉淀環(huán),菌落直徑為0.5mm
或更大,最低稀釋度平板低于1 5CFU 的記錄具體菌落數(shù)。
9.4 證實(shí)試驗(yàn)
從 VRBA 平板上挑取1 0個(gè)不同類型的典型和可疑菌落,少于1 0個(gè)菌落的挑取全部典型和可疑菌
落。 分別移種于 BGLB肉湯管內(nèi),3 6℃±1℃培養(yǎng)2 4h~4 8h,觀察產(chǎn)氣情況。 凡BGLB肉湯管產(chǎn)氣,
即可報(bào)告為大腸菌群陽(yáng)性。GB4 7 8 9.3—2 0 1 6
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9.5 大腸菌群平板計(jì)數(shù)的報(bào)告
經(jīng)最后證實(shí)為大腸菌群陽(yáng)性的試管比例乘以9.3中計(jì)數(shù)的平板菌落數(shù),再乘以稀釋倍數(shù),即為每
g(mL) 樣品中大腸菌群數(shù)。 例:1 0-4樣品稀釋液1mL,在 VRBA 平板上有1 0 0個(gè)典型和可疑菌落,挑
取其中1 0個(gè)接種BGL B肉湯管,證實(shí)有6個(gè)陽(yáng)性管,則該樣品的大腸菌群數(shù)為:1 0 0×6 / 1 0×1 0 4/ g(mL)=
6.0×1 0 5CFU/ g(mL)。 若所有稀釋度(包括液體樣品原液)平板均無菌落生長(zhǎng),則以小于1乘以最低稀
釋倍數(shù)計(jì)算。GB4 7 8 9.3—2 0 1 6
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附 錄 A
培養(yǎng)基和試劑
A.1 月桂基硫酸鹽胰蛋白胨(L S T)肉湯
A.1.1 成分
胰蛋白胨或胰酪胨 2 0.0g
氯化鈉 5.0g
乳糖 5.0g
磷酸氫二鉀(K 2HPO 4) 2.7 5g
磷酸二氫鉀( KH2PO 4) 2.7 5g
月桂基硫酸鈉 0.1g
蒸餾水 10 0 0mL
A.1.2 制法
將上述成分溶解于蒸餾水中,調(diào)節(jié)pH 至6.8±0.2。 分裝到有玻璃小倒管的試管中,每管1 0mL。
1 2 1 ℃高壓滅菌1 5m i n。
A.2 煌綠乳糖膽鹽(BGLB)肉湯
A.2.1 成分
蛋白胨 1 0.0g
乳糖 1 0.0g
牛膽粉(o x g a l l或o x b i l e)溶液 2 0 0mL
0.1%煌綠水溶液 1 3.3mL
蒸餾水 8 0 0mL
A.2.2 制法
將蛋白胨、乳糖溶于約5 0 0 mL 蒸餾水中,加入牛膽粉溶液2 0 0 mL(將2 0.0g脫水牛膽粉溶于
2 0 0mL 蒸餾水中,調(diào)節(jié)pH 至7.0~7.5),用蒸餾水稀釋到9 7 5mL,調(diào)節(jié)pH 至7.2±0.1,再加入0.1%
煌綠水溶液1 3.3mL,用蒸餾水補(bǔ)足到10 0 0mL,用棉花過濾后,分裝到有玻璃小倒管的試管中,每管
1 0mL。1 2 1 ℃高壓滅菌1 5m i n。
A.3 結(jié)晶紫中性紅膽鹽瓊脂(VRBA)
A.3.1 成分
蛋白胨 7.0g
酵母膏 3.0g
乳糖 1 0.0gGB4 7 8 9.3—2 0 1 6
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氯化鈉 5.0g
膽鹽或3號(hào)膽鹽 1.5g
中性紅 0.0 3g
結(jié)晶紫 0.0 0 2g
瓊脂 1 5g~1 8g
蒸餾水 10 0 0mL
A.3.2 制法
將上述成分溶于蒸餾水中,靜置幾分鐘,充分?jǐn)嚢?調(diào)節(jié)pH 至7.4±0.1。 煮沸2m i n,將培養(yǎng)基融
化并恒溫至4 5 ℃~5 0 ℃傾注平板。 使用前臨時(shí)制備,不得超過3h。
A.4 磷酸鹽緩沖液
A.4.1 成分
磷酸二氫鉀( KH2PO 4) 3 4.0g
蒸餾水 5 0 0mL
A.4.2 制法
貯存液:稱取3 4.0g的磷酸二氫鉀溶于5 0 0mL蒸餾水中,用大約1 7 5mL的1mo l / L氫氧化鈉溶
液調(diào)節(jié)pH 至7.2±0.2,用蒸餾水稀釋至10 0 0mL后貯存于冰箱。 稀釋液:取貯存液1.2 5mL,用蒸餾
水稀釋至10 0 0mL,分裝于適宜容器中,1 2 1 ℃高壓滅菌1 5m i n。
A.5 無菌生理鹽水
A.5.1 成分
氯化鈉 8.5g
蒸餾水 10 0 0mL
A.5.2 制法
稱取8.5g氯化鈉溶于10 0 0mL蒸餾水中,1 2 1 ℃高壓滅菌1 5m i n。
A.6 1m o l / LN a OH 溶液
A.6.1 成分
Na OH 4 0.0g
蒸餾水 10 0 0mL
A.6.2 制法
稱取4 0g氫氧化鈉溶于10 0 0mL無菌蒸餾水中。GB4 7 8 9.3—2 0 1 6
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A.7 1m o l / LHC l溶液
A.7.1 成分
HC l 9 0mL
蒸餾水 10 0 0mL
A.7.2 制法
移取濃鹽酸9 0mL,用無菌蒸餾水稀釋至10 0 0mL。GB4 7 8 9.3—2 0 1 6
9
附 錄 B
大腸菌群最可能數(shù)(MPN)檢索表
B.1 大腸菌群最可能數(shù)(MPN)檢索表
每g(mL)檢樣中大腸菌群最可能數(shù)(MPN)的檢索見表 B.1。
表 B.1 大腸菌群最可能數(shù)(MPN)檢索表
陽(yáng)性管數(shù)
0.1 0 0.0 1 0.0 0 1
MPN
9 5%可信限
下限 上限
陽(yáng)性管數(shù)
0.1 0 0.0 1 0.0 0 1
MPN
9 5%可信限
下限 上限
0 0 0 <3.0 — 9.5 2 2 0 2 1 4.5 4 2
0 0 1 3.0 0.1 5 9.6 2 2 1 2 8 8.7 9 4
0 1 0 3.0 0.1 5 1 1 2 2 2 3 5 8.7 9 4
0 1 1 6.1 1.2 1 8 2 3 0 2 9 8.7 9 4
0 2 0 6.2 1.2 1 8 2 3 1 3 6 8.7 9 4
0 3 0 9.4 3.6 3 8 3 0 0 2 3 4.6 9 4
1 0 0 3.6 0.1 7 1 8 3 0 1 3 8 8.7 1 1 0
1 0 1 7.2 1.3 1 8 3 0 2 6 4 1 7 1 8 0
1 0 2 1 1 3.6 3 8 3 1 0 4 3 9 1 8 0
1 1 0 7.4 1.3 2 0 3 1 1 7 5 1 7 2 0 0
1 1 1 1 1 3.6 3 8 3 1 2 1 2 0 3 7 4 2 0
1 2 0 1 1 3.6 4 2 3 1 3 1 6 0 4 0 4 2 0
1 2 1 1 5 4.5 4 2 3 2 0 9 3 1 8 4 2 0
1 3 0 1 6 4.5 4 2 3 2 1 1 5 0 3 7 4 2 0
2 0 0 9.2 1.4 3 8 3 2 2 2 1 0 4 0 4 3 0
2 0 1 1 4 3.6 4 2 3 2 3 2 9 0 9 0 10 0 0
2 0 2 2 0 4.5 4 2 3 3 0 2 4 0 4 2 10 0 0
2 1 0 1 5 3.7 4 2 3 3 1 4 6 0 9 0 20 0 0
2 1 1 2 0 4.5 4 2 3 3 2 11 0 0 1 8 0 41 0 0
2 1 2 2 7 8.7 9 4 3 3 3 >11 0 0 4 2 0 —
注1: 本表采用3個(gè)稀釋度[0.1g(mL)、0.0 1g(mL)、0.0 0 1g(mL)],每個(gè)稀釋度接種3管。
注2: 表內(nèi)所列檢樣量如改用1g(mL)、0.1g(mL)和0.0 1g(mL)時(shí),表內(nèi)數(shù)字應(yīng)相應(yīng)降低1 0倍;如改用0.0 1g
(mL)、0.0 0 1g(mL)和0.0 0 01g(mL)時(shí),則表內(nèi)數(shù)字應(yīng)相應(yīng)增高1 0倍,其余類推